随着微生物组学研究的深入，16S rRNA基因扩增子测序技术已成为解析微生物群落结构的重要工具。但是传统二代扩增子测序技术因检测读长短，只能对16S rRNA基因的部分区段（如V3-V4区或V4-V5区）进行检测，导致结果在“菌种”水平上的分辨率低，限制了对高度相似微生物物种的区分能力。

基于PacBio单分子实时（SMRT）测序平台的三代全长16S扩增子技术（覆盖V1-V9区域），凭借其长读长优势，显著提升了“菌种”水平分辨率，在多个领域展现出独特价值。然而，常见的三代全长16S扩增子测序仍然只能提供微生物相对定量而非绝对定量的结果，检测结果不全面，进而导致结论错误的问题。

图1.二代NGS和三代PacBio平台16S rRNA扩增子测序对比图（引文1）

为了应对以上挑战，昊为泰生物凭借多年来在微生物组绝对定量测序领域的技术和项目积累，已成功推出了基于添加Spike-in内标序列的AccuFL^TM三代全长扩增子绝对定量测序技术服务。该技术借助PacBio三代测序平台，实现了对16S rRNA基因（V1-V9区）的全覆盖检测，并且可以同时获得更为全面精准的绝对定量及相对定量分析结果，为定量微生物组学研究提供了又一强有力检测工具。

 昊为泰AccuFL^TM三代全长扩增子绝对定量测序技术原理与优势 

技术 · 原理

昊为泰AccuFL^TM三代全长扩增子绝对定量测序是在常规三代全长扩增子测序的基础上，增加了检测全长基因的绝对拷贝数。具体方法是通过向样品DNA中添加一系列人工合成内标序列，在同一体系中进行检测全长基因的文库构建，上机测序。测序数据中的内标序列数据通过生信方法提取，并根据其对应的绝对拷贝数进行标准曲线绘制。通过标准曲线可以计算获得各样本中检测全长基因的绝对拷贝数，从而实现在绝对拷贝数水平对样本中的全长基因丰度进行检测。此外，通过常规三代全长扩增子生信分析流程，可以同时获得相对定量测序，并且通过相对定量-绝对定量数据比较得到联合分析结果，更加全面准确地反映样本中微生物群落多样性信息。

图2.昊为泰三代全长绝对定量测序技术流程图

图3.昊为泰AccuFL^TM三代全长扩增子绝对定量测序流程图。A）实验流程图；B）生信分析流程图

技术 · 优势

1.显著提升“种水平”鉴定分辨率：采用更适合检测的16S V1-V9区进行扩增，显著提高了基因组DNA对菌种测序结果的影响。

2.减小引物偏差：使用基因全长引物，从而避免了二代测序不同区段引物的扩增偏差，使结果更加准确。

3.绝对定量+相对定量同时获得：引入内标序列，构建标准曲线，通过绝对拷贝数计算提供微生物群落的绝对定量和相对定量数据，使研究者能够全面了解微生物的真实丰度和多样性。

4.提高数据可比性：采用加入人工内标的绝对定量技术，可以确保不同实验批次检测结果的可比性，解决了由实验方法、批次差异等因素引起的技术误差，从而获得更加真实可信的比较结果。

5.技术方法成熟：该方法是在成熟的昊为泰Accu16S®细菌绝对定量测序专利技术平台基础上开发的。Accu16S®细菌绝对定量测序推出的六年多来，检测项目1300多项，发表SCI文章近百篇，这些都为植物内生菌检测打下了坚实的基础。

技术 · 应用领域

昊为泰生物的AccuFL^TM三代全长扩增子绝对定量测序在多个研究领域展现出其独特的优势，特别适合对“菌种”鉴定要求高，有后续菌种开发、功能验证相关研究。

1.医学领域：该技术在结合微生物组与疾病关系研究、整合多组学数据以揭示发病机制，及在临床转化中具有重要价值。例如，在健康组与疾病组肠道菌群的差异研究中，利用该技术能够更加准确的识别并对患者与健康人群肠道中的特定细菌菌种甚至菌株进行绝对定量，从而为疾病的预测和治疗提供重要线索。在菌群移植方面，研究者通过对移植后肠道菌群的动态定量检测，寻找关键菌种，对移植效果进行更加全面的评估。

2.食品发酵：在食品工业中，微生物的监控对于食品开发以及确保发酵质量等方面至关重要。通过全长扩增子绝对定量测序，开发者能够更加精准地识别和定量发酵过程中涉及的各类微生物的群落演替过程，进而为提升产品的稳定性和品质打下坚实基础。

3.环境研究：在污水处理和环境微生物群落分析中，该技术能够细致地分析污水处理系统中的功能性微生物种类及载量，这对于科学的评估潜在风险及环境承载能力，优化处理工艺、提高污水净化效果都具有重要意义。

4.农业与生态学：在农业研究中，尤其是土壤微生物群落的分析，全长扩增子绝对定量测序能够帮助揭示不同土壤条件下微生物群落的多样性和功能，为农业生态优化提供科学依据。

 昊为泰微生物AccuFL^TM三代全长扩增子绝对定量测序服务 

昊为泰生物的AccuFL^TM三代全长扩增子绝对定量测序技术，通过精确的实验设计和优化，可以确保实验结果的高度可重复性和一致性。根据我们实验室内部的检测结果表明，标准曲线拟合系数R²值大于0.99，线性良好，能够准确测量样本中的微生物，特别是菌种间拷贝数差异。通过与相对定量结果的对比，绝对定量测序展示了更高的准确性和良好的复现性，尤其在反映样本间真实差异及微生物群落动态变化方面表现突出。

图4.4份样本16S全长绝对定量测序标准曲线

（说明：标准曲线拟合系数R²均大于0.99，线性良好）

图5.4份样本16S全长测序绝对定量结果与相对定量结果

（说明：ZYMO-4比ZYMO-5样本实验体系中理论拷贝数低10倍。相对定量结果中8种细菌的相对含量在4份样本中基本相当，无差异；绝对定量结果中，ZYMO-5的2份样本的总拷贝数比ZYMO-4样本总拷贝数高约10倍，接近理论差异，rDNA全长绝对定量检测体系能够较准确的复现2种样本中的拷贝数差异。）

昊为泰生物AccuFL^TM三代全长扩增子绝对定量测序技术，凭借其长读长、低偏差、绝对定量优势，突破了传统二代测序技术的局限，在微生物组学的各个研究领域中发挥了重要作用。通过该技术，研究人员能够更准确地解析微生物群落的结构和功能，为医学、食品、环境、农业等领域的科研和应用提供有力支持。同时我们也需要认识到，由于PacBio平台相较二代NGS测序平台的检测成本仍然要高，数据检测通量也更低，这些仍是限制该技术应用的主要因素，研究者需结合个人的研究目标（例如是否需要得到更多物种水平信息）来对技术平台进行合理选择。

同时我们还提供宏基因组绝对定量技术、二代扩增子绝对定量技术、植物内生菌绝对定量测序和肿瘤内生菌绝对拷贝数等检测，具体见往期链接：1、多篇Nature、Cell正刊文章力推绝对定量测序：二代和三代全长扩增子绝对定量测序让基金申请的技术创新性更进一步！；2、昊为泰植物内生菌绝对定量测序：破解宿主干扰难题，精准定量微生物群落；3、肿瘤微生物—肿瘤微环境研究新方向。

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