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Technical Service
肿瘤内生菌绝对拷贝数检测
  • 天昊生物肿瘤内生菌绝对拷贝数检测,采用“16S qPCR绝对定量 + 16S rDNA扩增子测序”策略,可以根据qPCR绝对定量和16S rDNA扩增子相对定量测序结果,计算样品中微生物的绝对丰度。该技术将为肿瘤内生菌对肿瘤的发生发展及治疗预后效果等研究,提供了新的分析方法。

    技术路线:

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    16S qPCR实验技术路线


    技术优势:

    1、qPCR绝对定量检测采用的是TaqMan探针法而不是常见的SYBR green方法,可以获得更高特异性结果。

    2、qPCR绝对定量检测,采用细菌16S rDNA佳的通用引物。

    3、本实验16S rDNA扩增子测序采用的是高特异性、高灵敏度的扩增体系,极大程度上降低了宿主的非特异性扩增。

    4、目前我们的“天昊云”在线分析平台,已经上线配套的分析工具,便于项目客户对获得的qPCR绝对拷贝数和扩增子测序结果进行在线分析,真正实现了生信分析的自主高效。




  • 样品类型:主要针对肿瘤组织及DNA进行检测,可以是常规的新鲜冷冻组织样本,也可以是石蜡样本(未经染色),以及完整无污染的基因组DNA

    样品需求量:DNA≥50 ul(指按照DNA抽提试剂盒说明书要求的组织重量和洗脱体积进行抽提得到的DNA原液)(满足2次qPCR+测序实验);常规的软组织样本(样本需求量>=200mg,绿豆大小),未经染色处理的石蜡保存类型的样本,送样量不低于5片(10um厚度,组织大小在1cm2)

    送样方式:每个离心管用parafilm膜密封,冰袋运输

    DNA提取建议:常规组织样本选择FastDNA® Spin Kit for Soil(116560200,MP)进行DNA抽提,FFPE样本选择石蜡包埋组织 DNA 快速提取试剂盒(DP330,天根)进行DNA抽提





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    16S rDNA扩增子测序及与qPCR绝对定量检测数据的联合分析(天昊云)

     

    1、16S TaqMan qPCR部分:

    提供qPCR原始数据,以及导出的Ct值数据,结果达到:

    a. 标准曲线梯度:拟合系数:R2 ≥ 0.99;

    b. 3技术重复CV% < 5%(Ct < 30)。

     

    2、16S扩增子测序部分:

    提供PE250的fastq数据,以及相对定量测序分析内容,结果达到:

    a. 总数据量 ≥ 5万reads;

    b. Clean data Q30 ≥ 80%。




  • 1. Fu A, Yao B, Dong T, et al. Tumor-resident intracellular microbiota promotes metastatic colonization in breast cancer. Cell, 2022, 185(8): 1356-1372. e26.

    2. Yao B, Dong T, Fu A, et al. Quantification and characterization of mouse and human tissue-resident microbiota by qPCR and 16S sequencing. STAR protocols, 2022, 3(4): 101765.

     





  • 1、样本DNA浓度偏低,Qubit检测无浓度值的样本是否能进行内生菌绝对拷贝数检测?

    答:样本总DNA浓度无法代表目标基因的模板量,无法根据DNA的浓度来估算16S rRNA基因的拷贝数,建议进行16S rRNA基因Taqman qPCR检测的预实验,根据预实验结果来决定样本是否继续进行正式检测。

    其中针对低质量的石蜡肿瘤组织样本,由于样本本身保存方式造成的核酸降解、突变等情况,可能会造成检测结果拷贝数偏低,甚至出现假阴性结果的风险。

     

    2、样本同时进行16S TaqMan qPCR绝对拷贝数检测和16S扩增子测序,如何进行联合分析,得到微生物在绝对拷贝数水平上的群落结构差异?

    答:登录公司网站www.geneskybiotech.com,进入天昊云平台,选择“微生物qPCR绝对定量”项目,按照提示输入数据,运行程序,即可得到微生物在绝对拷贝数水平上的群落结构差异结果。详细可咨询生物信息部。

     

    3、16SV4区域扩增子测序结果中是否有高比例的宿主序列存在?

    答:实验采用的是高特异性、高灵敏度的扩增体系,极大程度上降低了宿主的非特异性扩增。目前测试项目16S的扩增子测序结果中(人,小鼠),几乎没有宿主序列的占比。





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