扩增子测序就是通过对基因组目的区域进行PCR扩增，将目标区域DNA扩增富集后进行高通量测序，然后将得到的序列与特定数据库比对，确认物种，然后进行生物信息分析的研究策略。目前扩增子测序服务主要包括细菌16S rDNA区/真菌ITS1区/真菌ITS2区/真菌18S rDNA区测序以及后续的数据分析工作，可有效研究特定环境中的物种信息，包括：物种差异、物种分类、物种丰度，对粪便、土壤，水体，瘤胃，淤泥等复杂环境中的微生物构成研究有重要的指导作用。

16S rDNA测序

16SrRNA为核糖体的RNA的一个亚基，16SrDNA就是编码该亚基的基因，存在于所有细菌基因组。16S rDNA大小适中，约1.5Kb左右，同时具有高度的保守性和特异性。16S rDNA既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，目前已被广泛用于病原菌的检测和鉴定。

18S rDNA测序

18S rDNA为编码真核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列。在结构上分为保守区和高变区，保守区反映生物物种间的亲缘关系，高变区反映物种间的差异，18S rDNA在进化速率上相对于ITS更加保守。

ITS 测序

在真核生物中，18S rDNA和28S rDNA转录间隔序列称为ITS区。ITS分为两个区域：ITS1/ITS2，ITS1位于18S和5.8S之间，ITS2位于5.8S和28S之间。ITS由于是非转录区，承受的选择压力较小，变异强。

技术优势：

   • 无需培养分离菌群，直接针对环境样本进行扩增子测序；

   • 高通量测序，大数据量、低花费；

   • PCR扩增设置多次重复，低循环数扩增，客观还原菌群结构及丰度比例；

   • 可发现环境微生物群落中新的微生物和基因，以及检测痕量菌。

样本类型：完整无污染的基因组DNA

样本浓度：浓度 ≥ 20ng/μL

样本纯度：OD 260/280介于1.8-2.0，OD260/230 ≥2.0

样本总量：总量 ≥ 500ng

16S/18S/ITS扩增子测序的分析流程通常包括：质控、序列处理（包括去除引物、合并序列、去除低质量序列、去除嵌合体等）、OTU/ASV聚类、物种注释、功能注释、多样性分析等。

试验及分析流程

1、为什么需要进行16S/18S/ITS扩增子测序？

答: 16S/18S/ITS扩增子测序可以帮助研究者快速准确地鉴定和分类微生物群落，了解样品中微生物的组成和多样性，进而探究微生物群落的功能和代谢途径等。

2、16S/18S/ITS扩增子测序适用于哪些样品类型？

答: 16S/18S/ITS扩增子测序适用于各种微生物样品，包括土壤、水样、肠道内容物、口腔拭子、皮肤拭子等。

3、什么是OTU和ASV？

答: OTU（Operational Taxonomic Unit）是一种基于序列相似度的聚类方法，将相似度高于一定阈值的序列聚为一类，代表一个潜在的物种。ASV（Amplicon Sequence Variant）是一种基于序列的变异性的聚类方法，可以更准确地代表物种。

4、16S/18S/ITS扩增子测序的结果如何解释？

答: 16S/18S/ITS扩增子测序的结果可以解释为微生物群落的组成和丰度信息，可以根据OTU/ASV的分类学注释、物种注释和功能注释等结果进行进一步分析和解释。同时，也可以使用多样性分析方法（如Alpha多样性、Beta多样性）对微生物群落的多样性和相似性进行分析。

4、16S/18S/ITS扩增子测序的应用有哪些？

答: 16S/18S/ITS扩增子测序可以广泛应用于微生物生态学、临床医学、环境监测、食品安全等领域。在微生物生态学中，可以用于研究微生物群落组成、多样性和功能特征等；在临床医学中，可以用于研究人体菌群的变化和与健康、疾病相关性；在环境监测中，可以用于研究水、土壤、大气等环境中微生物的分布和变化；在食品安全中，可以用于检测食品中的微生物污染情况。