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RNA qPCR检测即RNA定量PCR技术,是基因表达水平定量的金标准,也是转录组测序后对表达水平验证的必不可少的环节。RNA qPCR检测主要包括三个步骤,RNA的提取与质控、逆转录为cDNA、以及实时荧光定量PCR实验,
技术路线:
样品要求 | 常规mRNA定量 | a) 需求量:Total RNA总量> 1 μg;浓度≥ 50 ng/μL b) 纯度:OD260/280介于1.8-2.2之间 c) 完整度:RNA无明显降解,琼脂糖凝胶电泳28S/18S条带清晰可见 |
常规lncRNA定量 | a) 需求量:Total RNA总量> 1 μg;浓度≥ 50 ng/μL b) 纯度:OD260/280介于1.8-2.2之间 c) 完整度:RNA无明显降解,琼脂糖凝胶电泳28S/18S条带清晰可见 | |
常规miRNA定量 | a) 需求量:Total RNA总量> 500 ng;浓度≥ 100 ng/μL b) 纯度:OD260/280介于1.8-2.2之间 c) 完整度:RNA无明显降解,琼脂糖凝胶电泳28S/18S条带清晰可见 | |
定量方法 | ABI 7300/7900荧光定量PCR仪,SYBR Green相对定量法 | |
数据质量 | Ct < 30;溶解曲线单一;两重复平行性好 |
分析与结果:
基本分析 1) 靶基因与内参基因扩增曲线 2) 靶基因与内参基因溶解曲线 3) 靶基因与内参基因Ct值原始数据(SDS文件) 4) 靶基因相对表达量分析数据及柱状图展示 |
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