全转录组是指特定物种、组织或细胞在某个时期或条件处理下能转录出来的所有转录本的总和，包括所有mRNA和非编码RNA。目前的全转录组测序主要检测了mRNA和三种非编码RNA，即lncRNA、circRNA和miRNA。通过全转录组测序，可以分析各种RNA之间的相互作用及共表达调控网络，并且进行竞争性内源RNA的分析。

技术路线:

技术优势:

•两种建库方式，四种RNA“一网打尽”，更加全面获取样本中的RNA信息；

•一个样本四种RNA表达结果同时提供，大限度避免单独测序导致的系统误差；

•精确分析样本间不同类型RNA表达差异，更好反应变化趋势；

•整合分析四种RNA之间的共表达和调控关系，更好揭示生物学功能变化与调控机制。

样本类型：完整无基因组DNA污染的Total RNA

样本浓度：浓度≥ 200 ng/μL

样本纯度：OD260/280介于1.8-2.2，OD260/230 ≥ 2.0

样本需求量：总量≥ 4 μg

样本完整度：28S/18S ≥ 1.0， Agilent 2100 Bioanalyzer检测RIN值≥ 7.0

数据分析内容:

图 四种RNA单独分析流程图

图 四种RNA联合分析流程图

结果展示:

图 差异基因表达火山图

图 差异基因聚类热图

图  lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA调控网络图

EBioMedicine：环状RNA作为外周生物标志物应用于重度抑郁症诊断和治疗的潜在临床价值

    在发现集中进行了涉及16259个circRNAs的高通量测序，其中88个在7个MDD患者中与7个HCs相比有显著差异（图a）。随后，筛选出12个上调的circRNAs和3个下调的circRNAs，使用RT-qPCR在发现组中进行验证（图b）。后，4个circRNAs的表达在7个MDD患者和7个HC患者之间有显著差异，并与circRNA测序的结果一致（图c-f）。

图 circRNA表达检测和筛选

1.不同类型RNA的表达水平分别采用什么定量方法？

答：1) mRNA、lncRNA的表达定量方法：

一个基因表达水平的直接体现就是其转录本的丰度情况，转录本丰度程度越高，则基因表达水平越高。在RNA-seq分析中，我们可以通过定位到基因组区域或基因外显子区的测序序列（reads）的计数来估计基因的表达水平。Reads计数除了与基因的真实表达水平成正比外，还与基因的长度和测序深度成正相关。为了使不同基因、不同实验间估计的基因表达水平具有可比性，人们引入了FPKM的概念，即计算每个基因/转录本在样本中的FPKM值，以该值作为基因/转录本在样本中的表达量。FPKM是每百万reads中来自某一基因每千碱基长度的fragments数目，即两个reads能比对到同一个转录本的fragments数量。由于各基因碱基长度不同，在分析其特定表达量时，会将比对上的测序条数和其基因长度关联分析（具体公式见下）：

举例：比如对应到基因A的fragment有1000个，mapped到基因组的总fragments个数有100万，而基因A的外显子总长为5kb，那么对于基因A来说，total exon fragments=1000, mapped reads(millions)=1, exon length(kb)=5。所以基因A的FPKM=1000/(1*5)=200。此处，有的RNAseq数据分析结果里面会采用RPKM值统计表达量。RPKM和FPKM公式几乎一样，不同点就是FPKM计算的是片段（fragments），而RPKM计算的是数据（reads）。Fragment比read的含义更广，可以指pair-end的一个fragment，也可以是一个read。

2) circRNA的表达定量方法：

circRNA的定量采用直接计数的方式，将样本中检测到的来自该circRNA的reads数作为其表达量，在CIRI软件的输出结果中，会给出每个circRNA对应的表达量。

3) miRNA的表达定量方法：

miRNA的定量也是采用直接计数的方式，将样本中检测到的来自该miRNA的reads数作为其表达量。

2.全转录组测序一般建议需要多少个生物学重复样本？

答：对于临床样本来说，考虑到疾病的异质性，建议每组至少6个样本；对于模式动物，建议每组至少满足3个生物学重复。