“昊创新、好技术！”
昊为泰生物多年专注于深耕遗传学和基因组学等领域科研特色技术的开发，不断跟进国际先进的科研成果及技术发展，创新研发了许多特色专利技术和领域内前沿的检测服务项目，受到广大专业科研用户的认可和好评。
肠道微生物与宿主生理特性及疾病状态密切相关。然而，现有的微生物扩增子和宏基因组测序主要提供相对丰度信息，缺乏对微生物绝对丰度，也就是载量（每克微生物细胞数量）的绝对定量结果，这可能导致假阳性或假阴性结果，并影响微生物与疾病关联的准确性。
近日，《Cell》杂志上发表了Article文章Fecal microbial load is a major determinant of gut microbiome variation and a confounder for disease associations，研究团队利用机器学习方法，通过整合34539个全球宏基因组数据，预测发现了微生物载量与人类疾病的重要关联。本研究通过调整疾病关联分析中微生物载量的混杂效应，验证了模型在消除数据偏倚和增强疾病关联分析可靠性方面的作用。
多年来，昊为泰生物在微生物扩增子和宏基因组绝对定量测序专利技术的研发及应用上，都取得了可喜的成绩。利用昊为泰绝对定量技术，人们可以通过实验检测而非预测的方式，同时获得样本微生物的相对定量和绝对定量结果，数据更加全面，更加真实可信。（链接：1）基于Spike-in内标法 | 昊为泰首创微生物AccuMetaG宏基因组绝对定量测序专利技术服务，火热进行中！2）天昊微生物扩增子绝对定量六周年特刊 | 【绝对定量选天昊】专注微生物绝对定量技术创新，做定量微生物组学开创者！）
微生物载量与肠道微生物分类学特征的强相关性
本研究基于来自GALAXY/MicrobLiver和MetaCardis两个独立大规模研究队列的数据，探索了微生物载量与肠道微生物组分类学特征之间的关系。通过流式细胞术测定每个样本的微生物载量，并用mOTUs分析微生物的分类学特征。研究结果表明，微生物载量在不同的肠型之间（即Firmicutes、Prevotella和Bacteroides肠型）表现出显著差异，Firmicutes（例如Ruminococcus）肠型的微生物载量高，其次是Prevotella和Bacteroides肠型。在这两个队列中，微生物载量还与肠道微生物组的多样性指标（如Shannon多样性指数、物种丰富度和Simpson指数）显著正相关，表明较高的微生物载量通常伴随着更高的微生物多样性。
此外，微生物载量与微生物组中不同物种的丰度之间也存在显著的相关性。在载量较高的样本中，许多与肠道健康相关的短链脂肪酸产生菌（例如Oscillibacter、Faecalibacterium和Eubacterium属）显著增多，而载量较低的样本中，许多与疾病相关的物种（如Ruminococcus gnavus和Flavonifractor plautii）丰度增加，这些物种通常与炎症性肠病（IBD）和结直肠癌等疾病相关。此外，口腔中常见的微生物（如Streptococcus和Veillonella属）也在低载量样本中增多。研究表明，微生物载量对肠道微生物组的物种丰度有显著影响，而这些变化可能与宿主的健康状态及其微生物的代谢功能密切相关。
微生物载量还与肠道微生物组的功能基因丰度密切相关。在载量较低的样本中，脂多糖（LPS）合成相关的基因和与糖代谢（如磷酸转移酶系统和果糖/甘露糖代谢）相关的基因更加丰富，提示这些样本的代谢活动可能与低载量、短时间肠道传输和潜在的肠道炎症状态相关。而在载量较高的样本中，细菌鞭毛组装和趋化性相关基因的丰度增加，这表明在较高载量的微生物群落中，微生物可能表现出更多的运动性和趋化性，可能是对肠道环境适应的响应。
微生物载量与肠道菌群的分类特征密切相关
微生物载量能够从肠道微生物组的分类学和功能特征中稳健地预测
研究者基于肠道微生物组的分类学和功能特征，训练了eXtreme Gradient Boosting（XGBoost）回归模型，旨在从相对丰度数据预测粪便样本的微生物载量。模型训练使用了来自GALAXY/MicrobLiver和MetaCardis研究队列的样本数据，并通过交叉验证确保模型的稳健性。内部验证结果表明，模型可以准确预测微生物载量，GALAXY/MicrobLiver和MetaCardis研究队列的模型的皮尔逊相关系数分别为0.67和0.68。为了进一步验证模型的适用性，研究者将这些模型应用到其他数据集中，发现它们在外部数据集中的预测相关性依然显著（两个模型的皮尔逊相关系数均为0.56）。这些结果表明，基于分类学和功能特征的模型可以稳健地预测微生物载量。
除了宏基因组数据外，研究者还评估了16S rRNA基因数据在预测微生物载量中的效果。本文从两项先前研究中收集了16S rRNA扩增子测序和微生物载量的配对数据，并将这些数据用于模型的训练和验证。验证结果进一步证明了16S rRNA基因数据也能有效预测微生物载量。这表明，使用16S rRNA基因序列数据进行微生物载量预测具有较强的鲁棒性，尤其在数据量较大的情况下。
为了进一步测试模型对技术和生物学变异的稳健性，我们评估了不同实验室之间同一样本的技术重复性、不同DNA提取方法对模型预测的影响，以及纵向样本（来自同一人的不同时间点）的预测结果。结果表明，技术变异对微生物载量预测的影响较小，其中技术重复性（同一实验室内重复测量）产生的变异系数（CV）为0.12，远低于样本之间的生物学变异（不同个体间的变异系数为0.36）。这些数据进一步表明，微生物载量预测模型对技术变异的适应性较强，能够在多种实验条件下稳定运行。
预测的微生物载量与多种宿主因素显著相关
为了探讨预测的微生物载量与宿主因素之间的关系，研究者收集了来自159项研究的公共肠道宏基因组数据，涵盖了45个国家的27,832个样本（平均年龄46.3 ± 19.3岁，52.9%为男性）。此外，研究者还收集了两个大规模队列数据：日本的4D队列（4,198个样本，平均年龄66.4 ± 12.6岁，58.8%为男性）和爱沙尼亚微生物组队列（2,509个样本，平均年龄50.0 ± 14.9岁，29.7%为男性），这些数据包括了多种宿主和环境因素。通过冗余分析，研究者发现预测的微生物载量与宿主因素（如饮食、生活方式、疾病和药物治疗）之间有显著关联。
进一步分析发现，预测的微生物载量与宿主的性别、年龄、疾病状态、药物使用和饮食习惯等多个因素显著相关。例如，在全球数据集中，高收入国家的样本显著高于低收入国家的微生物载量，这表明收入水平较高的国家可能因饮食、卫生和生活方式的差异而表现出更高的微生物载量。在日本队列和爱沙尼亚微生物组队列中，药物使用对微生物载量的影响为显著，特别是抗生素的使用对微生物载量的下降影响尤为强烈。
研究还发现，饮食习惯与微生物载量之间存在一定的关系。例如，食用更多水果、蘑菇、绿茶和醋等食物的个体，其微生物载量较高。相比之下，饮酒的个体微生物载量较低。在饮食模式方面，全球数据表明，杂食者的微生物载量显著高于素食者和纯素者。此外，研究还发现Bristol排便指数与预测的微生物载量呈负相关关系，即粪便越软、排便频率越高，微生物载量越低。
在日本和全球数据集的分析中，年龄与微生物载量呈正相关关系。特别是老年人（>70岁）在微生物载量方面明显高于年轻人（<30岁）。性别在所有数据集中的微生物载量也存在显著差异，女性的微生物载量普遍高于男性，平均高出3.5%。这些发现与流行病学研究中发现的老年人和女性较慢的肠道传输时间一致。尽管这些关联在不同数据集中的强度有所不同，但普遍呈现出相似的趋势。
研究还发现，药物治疗对微生物载量有显著影响，尤其是抗生素的使用。在全球数据集、4D队列和爱沙尼亚微生物组队列中，抗生素的使用显著与较低的微生物载量相关。此外，不同类型的抗生素（如磺胺类、第三代头孢类、巨噬细胞抑制类抗生素）对微生物载量的影响也有所不同。这一发现为研究微生物载量与药物之间的相互作用提供了新的线索。
许多疾病与微生物载量的变化相关
为了评估不同疾病与微生物载量的关系，研究者进行了大规模的病例对照分析，结合了来自全球和日本4D队列的数据，涉及26种疾病。这些分析表明，26种疾病中有14种与预测的微生物载量显著相关，其中9种疾病与较低的微生物载量相关，5种疾病与较高的微生物载量相关。对于与低载量相关的疾病，患者的微生物载量通常比对照组低17.3%；而与高载量相关的疾病，患者的微生物载量则比对照组高7.7%。这些结果揭示了微生物载量在许多疾病中扮演着重要角色。
在14种与微生物载量较低相关的疾病中，包括了克罗恩病、溃疡性结肠炎、肝硬化、艰难分枝杆菌感染、艾滋病毒感染等。这些疾病通常伴随着腹泻症状，而腹泻常常导致肠道微生物载量的减少。研究发现，这些疾病患者的微生物载量显著低于健康对照组，表明肠道微生物载量可能是这些疾病的潜在标志物之一。
与较高微生物载量相关的疾病包括慢性便秘、结直肠癌、高血压等。患者的微生物载量比对照组高7.7%。这些疾病与便秘相关，而便秘通常会导致肠道内微生物的繁殖时间延长，从而增加微生物载量。研究结果表明，微生物载量的增加可能是这些疾病的一个生物学特征，提示其可能与肠道慢性状态有关。
肠易激综合征（IBS）是另一种表现出显著微生物载量差异的疾病。研究发现，在IBS的不同亚型中，腹泻型（IBS-D）与较低的微生物载量显著负相关，而便秘型（IBS-C）则与较高的微生物载量显著正相关。这些结果进一步证明，微生物载量的变化可能是IBS症状的一个潜在标志，尤其是在腹泻型和便秘型患者中。
通过对不同疾病的微生物载量进行分析，研究者进一步认识到微生物载量的变化可能不仅仅反映了肠道健康状况的变化，也可能直接影响疾病的发生和发展。例如，肠道微生物载量减少可能是肠道炎症性疾病的早期标志，而载量增加则可能与肠道慢性疾病（如结肠癌）及相关并发症相关。
预测的微生物载量与各种疾病相关性
微生物载量在疾病-微生物关联中的混杂效应
为了揭示微生物载量在疾病-微生物关联中的作用，研究者进一步在病例对照分析中加入了预测的微生物载量作为协变量进行回归分析。通过这种调整，研究显示微生物载量对许多疾病与微生物物种的关联产生了显著影响，尤其在某些疾病中，调整微生物载量后，疾病相关的物种和它们的统计显著性发生了明显变化。特别是对于7种疾病，调整微生物载量后，它们的效应量平均下降了21.9%-49.9%（平均为35.5%），并且23.6%-75.0%的原本显著的疾病-物种关联（FDR < 0.05）不再显著（FDR > 0.05）。这些结果表明，微生物载量在疾病-微生物关联分析中起到了重要的混杂作用。
在这些受微生物载量调整影响较大的疾病中，尤其是肠道相关疾病（如克罗恩病、溃疡性结肠炎和IBS-D），调整后许多先前显著与疾病相关的物种失去显著性。这表明，微生物载量的变化可能是这些微生物标志物变化的主要驱动因素，而非疾病本身。例如，某些疾病相关的物种在载量较低时更为丰富，而这些物种的变化可能与载量变化密切相关。通过调整微生物载量后，这些物种与疾病的关联性显著减弱。
在这些微生物载量调整后失去显著性的物种中，有一些是以前被认为的疾病标志物，例如Faecalibacterium prausnitzii和Eubacterium eligens，这些物种被认为在维持肠道健康中发挥重要作用。通过调整微生物载量后，这些物种与疾病的关联消失，表明它们的变化可能是由载量变化驱动的，而非疾病本身引起的。相反，某些在疾病组中富集的物种（如Fusobacterium nucleatum和Flavonifractor plautii）调整后依然保持显著，这表明它们可能更直接地参与了疾病的病理过程。
对于一些与微生物载量较高相关的疾病（如结肠癌、乳腺癌和肾脏疾病），调整微生物载量后，更多的物种变得与疾病显著相关。即便微生物载量的变化导致了疾病-物种关联的显著变化，但这些变化并不一定意味着微生物标志物的改变只是由于载量的变化。相反，许多在疾病组中表现出较强关联的物种，尤其是那些可能在肠道疾病中起到致病作用的物种，在调整微生物载量后依然保持较高的显著性。
1）预测准确性依旧有限，在精确预测微生物载量方面仍然需要进一步提高。2）微生物载量变化与特定肠道菌种之间的因果关系尚未明确，还需要进一步研究来阐明载量变化与物种动态之间的因果机制。3）该研究适用范围存在局限性，因为该模型的开发和验证基于儿童及成人的粪便样本，其对婴儿粪便样本、动物样本或活体组织活检样本的适用性尚不明确。4）对非原核生物的忽略。本研究主要聚焦于肠道微生物组中的原核微生物群落，未考虑病毒和真核微生物的影响。因此，该模型在预测整体微生物组多样性和功能方面可能存在一定的局限性。
本研究提供了一种预测肠道微生物载量的方法，为解析肠道微生物组与宿主特征及疾病的关系奠定了基础。研究结果表明，微生物载量不仅与肠道微生物组的分类学特征密切相关，还显著影响肠道微生物的物种丰度和功能基因的分布。这些发现进一步证明了微生物载量是决定肠道微生物生态系统多样性和代谢功能的一个重要因素，并且在肠道健康与疾病的关系中发挥着核心作用。这为微生物组研究提供了新的思路，即在解读微生物组数据时，必须考虑微生物的绝对丰度，而不仅仅依赖于相对丰度。然而，模型预测准确性仍有待提高，未来，结合微生物载量和相对丰度的数据将有助于提高疾病研究的准确性，并推动微生物组在临床应用中的应用发展。
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