往期相关链接：Olink蛋白组学常见问题解答（一）

Olink现已是世界上受信赖的下一代蛋白质组学平台之一，Olink的邻位延伸分析（Proximity Extension Assay，PEA）技术独特地结合了特异性和可扩展性，实现了高通量、多重蛋白质生物标志物分析。Olink已在广泛的人类疾病领域开展有极具影响力的研究，加深了对基础生物学的理解，并提供了可操作的生物标志物，以对患者进行分层，并加速药物开发。

我们将对Olink蛋白组研究中的常见问题做如下总结：

1：

什么是临位延伸分析（Proximity Extension Assay，PEA）？

答：Olink的临位延伸分析（PEA）技术通过双重抗体识别目标蛋白，将蛋白浓度数据转换成抗体偶联的DNA分子数目来实现检测。其独特地结合了特异性和可扩展性，实现了高通量、多重蛋白质生物标志物分析。在不影响数据质量或检测稳健性的情况下，使用几乎所有生物样本的小体积。

2：

Olink是否提供了检测Target 48小鼠细胞因子靶向蛋白的人类同源蛋白的panel，从而使转化研究成为可能？

答：Olink提供靶向人类蛋白的Target 48细胞因子组合。在Target 48小鼠细胞因子中与小鼠同源蛋白有42%的重叠。Olink的Flex文库涵盖了可通过Target 48小鼠细胞因子定量的75%的相应小鼠蛋白。

3：

有其他物种的panel吗，比如老鼠？

答：Olink提供了两种针对小鼠蛋白质的产品。Target 96小鼠探索性和Target 48小鼠细胞因子组合已表明Target 96 Mouse探索性panel也适用于分析大鼠蛋白质。

除了上面提到的小鼠组合，所有的Olink检测都是使用针对人类蛋白的抗体开发的。人类蛋白质和其他物种的同源物之间当然存在一定程度的抗体交叉反应。因此，我们panel中的一定比例的检测在非人类来源的样本中产生信号，一些客户已经在动物研究中使用它们。

Olink的人类panel只用于人类样本，但您当然可以根据自己的判断将其用于非人类物种的样本。

4：

有任何生物标志物可以同时被Target 48小鼠细胞因子和Target 96小鼠探索性检测到吗？

答：Target 96小鼠探索性和Target 48小鼠细胞因子有14个共同的生物标志物。使用同一样品，两种产品的结果具有很好的相关性。

5：

我们发现健康对照组的一些蛋白质的可检测性很低，为什么？

答：我们研究的一些蛋白质在体内具有非常广泛的表达水平，这使得我们难以开发一种可以同时测量健康和患病个体的多重检测方法。

例如，CVD检测panel主要是为了检测心血管疾病后或疾病期间可见的升高水平。如果你仍然想使用低可检测性的检测结果，你可以使用非参数统计（即在你的组中检测到vs.未检测到）。

6：

我可以拿到FASTQ数据并分析自己吗？

答：传统的DNA测序和用于Olink Explore读出的NGS测序之间有一个根本的区别。传统测序通常用于全基因组测序和突变筛查等应用。传统测序的问题是识别和读取根据参考基因组绘制的未知DNA序列，其中检查误差参数和评估未知序列错误读取的概率是重要的。Bcl数据文件是用于分析误差参数等的原始数据文件。

对于使用NGS读出的PEA，问题根本不同，而且相对容易。Olink定义的已知DNA序列被读取。我们只想计算每个已知序列的数量，以及这些数量与蛋白质浓度的关系。原始数据是计数文件，可用于标准化和处理数据。综上所述：Olink计数已知序列，计数的数量与蛋白质浓度直接相关。从NGS仪器中生成以下文件：首先是BCL文件，然后转换成COUNTS文件，然后生成包含蛋白质浓度结果的NPX文件。BCL包含有关分子设计的专有信息。对于Olink，只提供NPX数据。

7：

Olink Explore系列中的样本对照（Sample Control）是由什么组成的，如何在数据分析中使用？

答：样本对照是混合的血浆样品。这些被用作外部控制来估计板内和板间的精度。样本对照在Explore HT上运行一式三份，在Explore 384/3072上运行一式两份。对于Explore HT，样本对照随试剂盒提供。

8：

Olink可以提供NovaSeq输出文件中的原始数据吗？

答：传统的DNA测序和用于Olink Explore读出的NGS测序之间有一个根本的区别。传统测序通常用于全基因组测序和突变筛查等应用。传统测序的问题是识别和读取根据参考基因组绘制的未知DNA序列，其中检查误差参数和评估未知序列错误读取的概率是重要的。Bcl数据文件是用于分析误差参数等的原始数据文件。

对于使用NGS读出的PEA，问题根本不同，而且相对容易。Olink定义的已知DNA序列被读取。我们只想计算每个已知序列的数量，以及这些数量与蛋白质浓度的关系。原始数据是计数文件，可用于标准化和处理数据。综上所述：Olink计数已知序列，计数的数量与蛋白质浓度直接相关。从NGS仪器中生成以下文件：首先是BCL文件，然后转换成COUNTS文件，然后生成包含蛋白质浓度结果的NPX文件。BCL包含有关分子设计的专有信息。对于Olink，只提供NPX数据。

9：

Olink Explore系列中板内对照（Plate Control）是由什么组成的，如何在数据分析中使用它？

答：板内对照由来自健康献血者的混合血浆组成。这些用于数据标准化，以补偿运行和板之间的潜在变化。板内对照在Explore HT上重复5次，在Explore 384/3072上重复3次。

10：

Olink Explore系列中阴性对照（Negative Control）是由什么组成的，如何在数据分析中使用它？

答：Olink Explore的阴性对照由缓冲液运行组成，作为一个正常的样本。这些被用来监测DNA标签在没有事先与适当的蛋白质结合的情况下接近时产生的任何背景噪声。在Explore 384/3072中，阴性对照设置了每种蛋白质检测的本底水平，并用于计算检测限（LOD）。在Explore HT中，阴性对照用于评估潜在污染。阴性对照在Explore HT上重复两次，在Explore 384/3072上重复三次。

11：

LOD是什么意思？

答：检测限（LOD）是单个蛋白质的低可测量水平，LOD定义为背景标准差的3倍。

12：

NaN是什么意思？

答：NaN是指“非数字”，通常用作低于检测限（LOD）的数据值的替代。

13：

动态范围是什么意思？

答：动态范围是指定量下限（LLOQ）和定量上限（ULOQ）之间的区域。在这个范围内，定量是可能的，具有良好的准确性和精密度。

14：

LLOQ和ULOQ是什么意思？

答：分析测量范围由定量下限（LLOQ）和定量上限（ULOQ）确定。

15：

Olink panel中的生物标志物是如何被选择的？

答：在构建新panel时，我们从Uniprot、人类蛋白图谱（Human Protein Atlas）、基因本体论（Gene Ontology）和DisGeNET等广泛使用的公共生物信息学数据库收集信息。

我们选择和评估了已知和探索性生物标志物的组合，以获得合适的抗体，然后需要通过我们严格的验证测试和要求。选择过程和panel组成是根据各领域专家的意见制定的。

16：

运行Olink Focus，Olink Flex，Olink Target 96或Olink Target 48需要什么仪器？

答：如果您正在您的实验室运行我们的panel，Olink Signature Q100需要用于检测和量化。在试验方案的延伸步骤中，还需要一个经过验证的PCR仪器，该仪器的反应量为100µL，带有加热的盖子。

Standard BioTool的BioMark HD Reader和IFC Controller HX/MX/AX/Juno可以用来代替Olink Signature Q100。

17：

我是否应该稀释我的样品后再运送给Olink？

答：一般来说没有。对于我们的稀释panel，我们稀释您的样品作为分析的一部分。然而，如果您正在运行血清或血浆以外的基质样本，我们建议您与您的销售代表或我们的Olink支持团队讨论稀释度，以及在某些情况下的蛋白浓度或细胞密度（例如，裂解物或细胞培养上清液）。

18：

NPX Signature是什么？

答：Olink NPX Signature是一个易于使用的质量控制、标准化和统计分析工具。该工具允许您验证数据质量、标准化Olink数据并执行统计分析。

19：

可以提供定制化的panel吗？

答：Olink提供两种定制panel：

Olink Flex panel高度灵活，可定制。他们使您能够选择和结合目标多达21人蛋白质在一个panel，结果报告以绝对定量（pg/mL）和相对定量（NPX）形式。在广泛的混合匹配库中，从超过200种与炎症相关的人类蛋白质中选择，这些蛋白质具有99%的结合能力。

Olink Focus panel可通过我们的研发专家定制项目提供，并为多达21种客户选择的蛋白质提供检测，可选择绝对或相对定量。

20：

是否有软件程序对Olink Target，Olink Flex和Olink Focus进行数据预处理和分析？

答：为了更容易的数据分析，Olink蛋白质组学开发了一个软件，NPX Signature，可以用于从Olink分析产生的数据。这是一个易于使用的工具，可以让您导入，质量控制和规范化您的Olink数据，为您提供标准化蛋白表达（NPX）或pg/mL值，可以用于在相同的软件中进一步的统计分析。

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