近年来，以Nature为代表的各类期刊文章，一次又一次的证明并呼吁，是到了该抛弃只依靠微生物相对定量数据下结论的时代了！

这一次，来自欧洲的科研人员，再次强调了微生物绝对定量检测的重要性，并结合混杂因素控制，对前人在结直肠癌微生物标志物的有效性提出了挑战，相关研究结果发表在了近期的《Nature Medicine》（IF58.7）上。同期，我国焦娜/朱立新/朱瑞新研究团队还受邀对该文发表微生物-疾病关系鉴定的评述文章。

英文题目：Microbiome confounders and quantitative profiling challenge predicted microbial targets in colorectal cancer development

中文题目：微生物组混杂因素和定量分析对结直肠癌发展中的预测微生物靶点提出了挑战

发表期刊：Nature Medicine

发表期刊：58.7

发表时间：2024

尽管癌症微生物组研究取得了实质性进展，但是混杂因素和绝对定量微生物组仍未得到充分利用的问题，都引发了人们对潜在虚假关联的担忧。

本文研究人员检测了589 名不同结直肠癌 （CRC） 阶段患者的粪便菌群结果，并与多达 15 项已发表的研究（总共 4,439 名患者和对照组）进行比较。研究者使用基于 16S rRNA 扩增子测序的绝对定量微生物组分析，结合严格的混杂因素控制，将转运时间、粪便钙卫蛋白（肠道炎症）和体重指数确定为主要微生物协变量，取代了 CRC 诊断组解释的方差。在控制这些协变量情况下，之前被普遍认可的微生物 CRC 靶点（如核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum））与 CRC 诊断组（健康和肿瘤）之间并没有发现显著相关性。相比之下，本文新发现的阴道厌氧球菌（Anaerococcus vaginalis）、肺炎双歧杆菌（Dialister pneumosintes）、米克拉细小单胞菌（Parvimonas micra）、厌氧肽链球菌（Peptostreptococcus anaerobius）、溶糖卟啉单胞菌（Porphyromonas asaccharolytica）和中间普雷沃氏菌（Prevotella intermedia）与CRC的发展存在显著相关性，凸显了其未来的靶点潜力。后，本研究发现符合结肠镜检查标准（例如，通过粪便免疫化学试验阳性）但没有结肠病变的对照个体富集了菌群失调的拟杆菌 2 肠型，强调了在癌症微生物组研究中定义健康对照的不确定性。总之，这些结果表明了绝对定量微生物组分析和协变量控制对 CRC 微生物组研究中生物标志物鉴定的重要性。

研究背景

结直肠癌（CRC）的发病率稳步上升，特别是在50岁以下人群中。估计在美国和比利时，每10万人中分别有约16人和14人每年死于CRC。由于医疗干预可以有效减少CRC的进展和相关死亡率，确定高风险个体至关重要。

通过腺瘤切除的结肠镜检查可以将CRC风险减少高达90%。早期识别有息肉的个体可以减少全球CRC负担。然而，确定高风险患者仍然具有挑战性，强调了需要进行全人群筛查

微生物群的变化已与多种疾病表型相关。一些细菌标志物，如梭杆菌，在发展中和发达国家的CRC患者病变和粪便中均有富集，表明微生物组可能在诊断和/或预后中发挥潜在作用。

尽管微生物组分析受到多种变量的影响，这些变量可能干扰或复合生物现象，协变量控制仍远未成为标准。例如，尽管显示出对整体肠道微生物群变化具有大解释力，转运时间的替代指标——湿度含量仍未被控制。肠道炎症（通过粪便钙卫蛋白测量）比粪便潜血更敏感，可以识别CRC患者，因此是分子粪便CRC筛查的潜在目标。

微生物相对定量分析（RMP，分类丰度以百分比表示）仍是微生物组研究的主要方法。然而，鉴于相对定量RMP在组成性和相对分析解释中存在着明显缺陷，越来越多的研究已经推荐使用绝对定量检测方法检测，这可以减少下游分析中的假阳性和假阴性率，从而降低了对微生物组关联的错误解释的风险。尽管绝对定量微生物组分析（QMP）有助于不同样本或条件下的标准化比较，但迄今为止尚未进行QMP CRC微生物组研究。 

在本文中，研究者解决了CRC微生物组研究中的两项空白：（1）定量表征与恶性结肠转化相关的微生物组特征；（2）识别可能掩盖微生物组-CRC关联背后的生物现象的微生物协变量。这是首个结合绝对定量分析与微生物组协变量的广泛分析，以区分疾病相关信号和混杂因素信号的大规模结肠癌发展阶段肠道微生物组研究。

研究结果

结直肠肿瘤患者的肠道炎症更高

本研究招募了650名在2017年至2018年间在鲁汶大学医院（UZL）接受结肠镜检查和结肠切除术的志愿者，这些志愿者在结肠手术前提供了粪便样本。研究根据详细的结肠镜检查和临床评估将参与者分为三组：（1）无结肠病变的患者（CTLs，n = 205），（2）有息肉的患者（考虑息肉为癌前病变；数量<10且大小在6至10 mm之间）（ADE，n = 337），（3）CRC患者（n = 47；2（4%）为0期，14（30%）为I期，13（28%）为II期，11（23%）为III期，3（6%）为IV期，4（9%）为未定期）。研究者排除了不符合这些标准的患者，以及那些临床和分子数据不足的患者。终本研究队列（LCPM）由589名患者组成。结肠镜检查的常见指征是粪便免疫化学测试（FIT）阳性或腺瘤监测。其他指征包括家族风险、腹部症状和排便习惯的改变。

为了识别与诊断组相关的元数据变量，研究者使用了两种统计方法：（1）对所有数值变量进行非参数Kruskal-Wallis（KW）检验；（2）对分类变量进行卡方（CS）检验，随后进行Benjamini-Hochberg多重检验校正。终发现有八个变量与诊断组相关（假发现率<5%），即：年龄、体重指数（BMI）、钙卫蛋白、报告的睡眠时间、既往癌症（包括CRC）、牙齿状态、糖尿病治疗和高血压（图1）。

已知的混杂因素而不是分组，解释了CRC发育阶段的整体微生物群变异

为了揭示CRC发展阶段中整体微生物组变异的决定因素，本文首先评估了多个可能的已知混杂因素对微生物组组成的影响。本研究将测序数据与粪便微生物载量的流式细胞术测量相结合以获得QMP数据。使用Bray-Curtis距离度量微生物组样本之间的异质性。主坐标分析（PCoA）在物种水平的 Bray-Curtis 差异 （BCD）结果发现，组之间没有显著差异。此外，组间总微生物负荷没有差异。而基于距离的冗余分析（dbRDA）揭示了该队列中与微生物变异相关的24个微生物群协变量，进而确定了 17 个非冗余协变量，它们共同解释了6.7% 的微生物群组成变异（图1）。

图1、LCPM队列和肠道菌群在CRC进展中的协变量。a，本研究流程图和队列规模。CTL代表没有结肠病变的患者，ADE代表结肠息肉患者，CRC是指结直肠肿瘤患者。b，LCPM队列患者的结肠镜检查转诊原因：FIT阳性、腺瘤监测、家族风险癌症（FCC）、遗传性非息肉病CRC（HNPCC）和排便变化。NA，表示没有信息的患者比例。c，年龄、BMI和钙卫蛋白与诊断组相关。d，既往非结直肠癌、高血压和糖尿病治疗与诊断组分布相关。e，BCD（代表LCPM队列中QMP物种水平的微生物群变异）上的PCoA。f， 显著协变量对微生物群落变异的累积效应大小与单个效应量（R2）假设 LCPM 队列中的协变量独立性。

梭杆菌与CRC分期的关联在控制混杂因素或使用QMP时消失

虽然在使用相对定量RMP的CRC研究中报道了多种微生物关联，本研究使用绝对定量QMP来鉴定其绝对丰度与诊断组相关的物种，结果发现在诊断组间只有8个物种的丰度存在显著差异。以前多项研究发现的核梭杆菌与结直肠病变相关，但在本研究中，检测的梭杆菌核丰度与CRC无关（图2）。

图2、结直肠癌进展中的微生物生物标志物。a，物种在诊断组间绝对丰度存在差异。b，鉴定出物种诊断组间相对丰度存在差异。c，生物标志物关联及其混杂因素。

多种已建立的CRC微生物标志物与转运时间、肠道炎症和体重指数相关，但与CRC分期无关

梭杆菌丰度与粪便钙卫蛋白、水分含量，以及BMI的关联促使研究者对这种混杂因素和先前报道的CRC相关菌属的影响进行深入分析， 为此，研究从10个已发表的队列中编制了一份包含89个CRC物种水平标记的清单（包括 1,633 个样本）和来自 15 个队列的 67 个属级标记（代表 4,439 个样本）。

分类群丰度与三个焦点协变量之间的Spearman相关性揭示了微生物靶标与该物种的这些混杂因素和属水平之间的强关联（图3a）。这些关联中的大多数在独立人群队列 （FGFP） 中重复，表明这些关联是稳健的。

当研究者使用RMP和QMP进行了分析，发现只有 8%（89 个中的 6 个）和 10%（89 个中的 9 个）先前与CRC相关的物种在混杂控制后得以重复，表明这两个物种的先前关联可能是虚假的（图3a）。

图3、BMI、肠道炎症和水分与微生物生物标志物和CRC的相关性。a，b，先前报道的与CRC相关的物种（a）和属（b）。粪便钙卫蛋白、BMI 和水分值与 LCPM （N = 589） 和 FGFP （N = 1,045） 队列的QMP和RMP成对分析的 Spearman 等级相关性。

结肠镜检查患者，无论是否患有结直肠癌，都表现出过多的Bact2肠型

为了在群体背景下研究 LCPM 队列，研究者在 FGFP 样品 （n = 1,045） 中观察到的微生物变异背景下，在属水平上对参与者进行肠型分析。对LCPM队列诊断组中菌群失调的Bact2肠型患病率的成对比较显示，与FGFP人群相比，该肠型在所有CRC诊断组中都富集，该组中的Bact2肠型表现出生态失调的所有特征：细胞计数低、丰富度低、钙卫蛋白值高、丁酸盐产生者减少和促炎细菌增加。

图4、Bact2肠型在转诊进行结肠镜检查的患者（有和没有结直肠病变）中富集。

研究结论

本研究提供了强有力的证据，提醒研究者重新审视潜在的微生物与临床表型的关联，以确保所谓的关联不是由不受控制的协变量驱动的，从而保证进一步跟踪这些关联背后的机制。改进发现微生物生物标志物的方法无疑将影响微生物群领域，促进通往临床应用的道路。

同期，我国焦娜/朱立新/朱瑞新团队还受邀对该文发表微生物-疾病关系鉴定的评述文章。该文强调了通过定量微生物组数据和混杂因素的控制策略，挑战了先前报道的结肠直肠癌微生物标志物的有效性，为微生物组研究领域敲响了警钟。

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