Olink现已是世界上受信赖的下一代蛋白质组学平台之一，Olink的邻位延伸分析（Proximity Extension Assay，PEA）技术独特地结合了特异性和可扩展性，实现了高通量、多重蛋白质生物标志物分析。Olink已在广泛的人类疾病领域开展有极具影响力的研究，加深了对基础生物学的理解，并提供了可操作的生物标志物，以对患者进行分层，并加速药物开发。

我们将对Olink蛋白组研究中的常见问题做如下总结：

1：

Olink蛋白组适合什么样的样本类型？

Olink的panel使用EDTA血浆和血清样本进行验证。一系列其他类型的样本与Olink的PEA技术兼容，如柠檬酸盐血浆、肝素血浆、组织和细胞裂解物、细针活检、微透析液、细胞培养基、干血斑、滑液、脑脊液、斑块提取物和唾液等。

2：

Olink检测的灵敏度是多少？

答：在panel验证过程中，我们准备了一个2倍稀释的标准曲线来计算LOD，LLOQ， ULOQ和hook。Olink技术具有可媲美或优于ELISA检测的灵敏度，可降至fg/mL。每一项实验都被彻底验证以检测EDTA血浆中的生理和病理蛋白水平。

3、

使用Olink技术的蛋白质组学测序与传统DNA测序的主要区别是什么？

答：Olink是使用NGS作为工具来检测样本中特定蛋白质生物标志物的相对浓度。在样品和文库制备过程中，产生了每个蛋白质生物标志物具有独特序列的短片段DNA。测序后，特定DNA序列的计数数目（reads）与原始蛋白质生物标志物浓度成比例。

4、

使用一个Target 96试剂盒可以分析多少个样品？

答：一种Olink Target 96试剂盒含有足以分析90份样本的试剂，以及6份对照品（阴性对照和板间对照各3份）。我们还建议添加重复的外部样本对照（例如混合血浆），这是将样本送到我们的分析服务实验室时的标准做法。包含重复的外部样品对照当然会将每个试剂盒可检测的单个样品数量减少到88个。

5、

在一个Olink Explore试剂盒中检测了多少蛋白生物标志物？

答：Olink Explore HT检测约5400个生物标志物。一个Explore 384试剂盒包含约368种蛋白生物标志物，而一个Explore 3072由8个Explore 384 panel组成，平行检测约2925种蛋白质。

6、

每个样本需要分析多少次重复？

答：除非客户要求，Olink不会进行样本重复。一般来说，生物学变异超过了技术变异，所以客户往往专注于使用不同的样本，而不是重复。Olink的panel中的大多数检测的intra-CVs低于10%。

7、

我该如何比较两项不同研究（不同批次）的结果？

答：为了减少结果中的技术差异，Olink建议在分析前对样本进行随机化，并对结果进行强度标准化。当分析不同时间点的2项或多项研究的结果时，如果两项研究之间的样本不能被认为是随机的，Olink建议在每项研究中包括8-16个桥接样本。如有可能，这些桥接样本应代表整个研究，例如包括所有研究组，并应与其他样本进行类型匹配。在合并之前标准化的数据集时可以应用桥接样本进行归一化。

8、

Olink检测提供绝对或相对定量吗?

答：Olink Target 96和Olink Explore panel采用相对定量，数据采用Olink自己的相对单位NPX（Normalized Protein eXpresstion，标准化蛋白表达）。这些产品用于高通量蛋白质分析，分析一组人群相对于另一组的蛋白质表达变化的定量，例如患者vs.对照，或治疗前样本vs.治疗后样本。

Olink Target 48，Olink Flex和Olink Focus panel可以根据客户的需求提供相对（NPX）和绝对定量（pg/mL）的数据。

9、

NPX是什么？

答：NPX（Normalized Protein eXpresstion，标准化蛋白表达）是在Log2尺度下的Olink任意单位。它是由Ct值来计算的，数据预处理（归一化）以小化批内和批间的差异。NPX数据允许用户识别不同样本中单个蛋白质水平的变化，然后使用这些数据建立蛋白质特征。

与Ct相比，NPX尺度相反，这意味着高NPX值等于高蛋白质浓度。因为NPX是log2刻度，一个NPX的差异意味着蛋白质浓度加倍。如果需要，NPX值可以转换成线性刻度：2NPX=线性NPX。

10、

如何将Olink Target 96的NPX结果用于量化？

答：使用Olink的Target 96 panel，通过相对定量分析结果，即分别检测每种蛋白的蛋白表达变化。由于相对定量的性质，不需要内部标准。NPX以log2刻度表示，其中高值对应较高的蛋白质表达。

11、

在两个不同的panel中分析过的蛋白质，我们能期望得到相同的结果吗？

答：NPX绝对值在各个panel上并不会相同。然而，确实期望多个panel测量的分析物在样品之间的比率相同。

12、

Olink提供啮齿动物相关panel吗？

答：Olink提供了两种针对小鼠蛋白质的产品，Target 96 Mouse Exploratory（小鼠探索性）和Target 48 Mouse Cytokine（小鼠细胞因子）panel。现已表明Target 96 Mouse Exploratory也适用于分析大鼠蛋白质。

13、

是否对Target 48小鼠细胞因子panel与其他物种的交叉反应进行了检测？

答：我们已经检测了与人类同源蛋白的交叉反应性，结果显示只有一项实验检测到其人类同源蛋白Cxcl12，交叉反应性为13%。这说明该panel的设计具有极佳的物种特异性。

14、

 用Target 48小鼠细胞因子对哪些样本进行了测试？

答：在Target 48小鼠细胞因子的开发过程中，已经测试了多种其他样本类型，如尿液、支气管肺泡灌洗液和组织裂解物。

15、

Olink Target 48和Olink Flex的样本对照（Sample Control）是由什么组成的，如何在数据分析中使用？

答：样本对照是一种混合的人血浆样本，加入了一些蛋白的重组抗原，以确保检测到所有45种蛋白。样本对照在每个板上包含一式三份。样本对照用于评估批间和板间的潜在变化，以及pg/mL数据定量的质量控制。所有panel的验证数据都可以在Olink网站上找到。

16、

Olink Target 48的校准物（Calibrator）是由什么组成的，它是如何用于数据分析的？

答：Target 48细胞因子（人）中的校准物是一种混合的人血浆样本，加入了针对内源性低水平蛋白的重组抗原，以确保所有45种蛋白均在定量限内检测到。Target 48小鼠细胞因子中使用的校准物由含有重组蛋白的缓冲液组成。在Olink的开发过程中，两种产品都使用Calibrator沿y轴调整预定义的标准曲线。Calibrator在每个板上一式三份，用于标准化所有样品。

17、

Olink Target 96的板间对照（IPC）是由什么组成的，如何在数据分析中使用？

答：板间对照（IPC）包含panel中用于每种检测的两个互补DNA标签偶联的抗体，因此它们已经接近。IPC在每个板上包含一式三份，用于标准化和补偿潜在的序列偏差和批次/板之间的变化。

18、

Olink Target 96的板间对照（IPC）是由什么组成的，如何在数据分析中使用？

答：样本对照是将混合的血浆样本在每个panel上重复运行，每个板上包含一式两份。这些被用作外部对照来估计批间/批内的精确度。

19、

 Olink Target 96, Olink Target 48, Olink Focus和Olink Flex的阴性对照（Negative Control）是由什么组成的，如何在数据分析中使用？

答：阴性对照在每个孔板上包含一式三份，由正常样品的缓冲液运行组成。这些被用来监测DNA标签在没有事先与适当的蛋白质结合的情况下接近时产生的任何背景噪声。阴性对照设置每种蛋白质检测的本底水平，并用于计算检测限（LOD）。

20、

 Olink Target 96和Olink Explore的数据归一化？

答：为了减少孔板和研究之间的技术差异，Olink建议对样本进行随机化，并在统计分析之前进行强度归一化。对于随机抽样的项目，Olink建议使用孔板中位数作为归一化因子进行强度归一化。强度归一化对数据进行调整，使各孔板上每次检测的中位值相等。

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