孤独症谱系障碍（ASD）是一种以社交障碍和刻板行为为特征的神经发育障碍性疾病。在发达国家，自闭症障碍的患病率从0.76%上升到1-2.5%。在中国，ASD的患病率约为0.7%-1%。大量研究表明，妊娠期暴露于环境毒物导致儿童ASD发病率迅速上升。多项队列研究证实，母亲接触机动车尾气会增加儿童患孤独症的风险。1-硝基芘（1-NP）是柴油尾气颗粒和烹饪排放的独特的硝基-多环芳烃。一项较早的报告表明，妊娠晚期1-NP（10 μg/kg）暴露与青春期子代学习和记忆能力下降相关。妊娠期1-NP（10、100 μg/kg）暴露可引起成年期大鼠焦虑样行为。尽管这些神经系统疾病与1-NP暴露有关，但目前尚不清楚母亲1-NP暴露是否会诱发子代的孤独症样行为。

越来越多的证据表明，前额叶内侧皮质（mPFC）中的中间神经元在社会交流的调节中起着重要作用。两份报告显示ASD患者mPFC的中间神经元减少。在啮齿类动物中，中间神经元起源于神经节隆起，并在大脑发育的中后期切线迁移到新皮质。近，两项研究表明，中间神经元迁移迟缓导致小鼠出现孤独症样行为。目前普遍认为几种与中间神经元迁移相关的分子，包括Nrg1和Sema3F参与调控中间神经元的迁移。多项研究表明，羟甲基化修饰参与胎盘滋养细胞和神经干细胞的迁移。之前的研究也表明Nrg1可以通过羟甲基化修饰进行转录调控。

因此，为了探讨生命早期1-NP暴露对小鼠孤独症样行为的影响，并揭示胎鼠前脑中中间神经元迁移的潜在作用。安徽医科大学卫生毒理学系徐德祥及王博团队共同通讯于2024年5月16日在Advanced Science杂志（IF：15.1，中科院1区）上在线发表了新研究成果“产前1-硝基芘暴露可部分通过改变发育中大脑的DNA羟甲基化导致自闭症样行为”。

这项研究表明母体1-NP暴露通过延缓胎鼠前脑中间神经元迁移而导致孤独症样行为。该研究提供的证据表明生命早期1-NP暴露部分通过破坏发育大脑中与中间神经元迁移相关的基因的表观遗传重编程来延缓中间神经元的迁移。母亲补充α-KG可改善1-NP暴露后代的中间神经元迁移和孤独症样行为。

天昊生物为本研究中的表观遗传研究提供了目的基因羟甲基化测序技术服务，下边让我们看看文章的主要结果吧！

整体的研究设计及小鼠的处理如图1所示，主要包括5组实验内容。

图1 动物及处理的实验流程图

1 母体1-NP暴露对后代自闭症样行为的影响

在社会行为测试中，被试鼠通常表现出与陌生1小鼠互动的偏好，嗅闻陌生1小鼠的时间比在空笼中的时间更长（图2A，G）。在社会新奇行为测试中，被试鼠通常表现出对陌生2小鼠的互动偏好，在陌生2小鼠上嗅探的时间比在陌生1小鼠上嗅探的时间长（图2D，J）。本研究是对断乳仔鼠进行社会行为测试。虽然高剂量组的断乳雄性小鼠表现出对与陌生1小鼠互动的偏好，但在低剂量组中未观察到这一点（图2B）。另一方面，高剂量组的断乳雌性实验小鼠没有显示出与陌生人1鼠标交互的偏好（图2C）。断乳仔鼠进行社会新奇行为测试，结果表明，低剂量组的断乳雄性测试小鼠表现出对与陌生2小鼠互动的偏好，而高剂量组的小鼠则没有这种偏好（图2E）。来自高剂量组的断乳雌性测试小鼠显示出与接受高剂量1-NP的雄性小鼠相似的表型（图2F）。

随后，对成年子代的社会行为和社会新奇行为进行进一步评估。在社会行为测试中，两个1-NP组的成年雄性测试小鼠没有表现出与陌生1小鼠交互的偏好（图2H）。另一方面，高剂量组的成年雌性小鼠表现出对与陌生1小鼠交互的偏好，但在低剂量组中未观察到这一点（图2I）。在社会新奇行为中，来自两个1-NP组的成年雄性测试小鼠未表现出与陌生2小鼠互动的偏好（图2K）。此外，低剂量组的成年雌性小鼠表现出对与陌生2小鼠交互的偏好，而对高剂量组的小鼠则没有这种偏好（图2L）。

图2 母体1-NP暴露对断乳后代自闭症样行为的影响

2 妊娠期1-NP暴露对胎鼠前脑中中间神经元迁移的影响

GD18雄性胎鼠前额叶内侧皮质（mPFC）检测到GAD67（中间神经元标志物）的表达。如图3A，B所示mPFC中GAD67蛋白在1-NP暴露的雄性胎鼠中下调。利用免疫荧光染色对不同层面的GAD67+中间神经元进行检测（SVZ：室管膜下区；VZ：脑室区；IZ：中间区；CP：皮质板；MZ：边缘区）。虽然在IZ层的GAD67+中间神经元在两组之间没有差异，但在1-NP组的雄性胎鼠的mPFC中，CP层和MZ层的GAD67+中间神经元减少（图3C，D）。相比之下，1-NP组雄性胎鼠SVZ/VZ层GAD67+中间神经元增多（图3C，D）。其次，在雌性胎鼠的mPFC中检测到GAD67。mPFC中GAD67蛋白在1-NP暴露的雌性胎鼠中下调（图3E，F）。虽然IZ层的GAD67+中间神经元在两组之间没有差异，但在1-NP组的雌性胎鼠中，CP层和MZ层的GAD67+中间神经元减少（图3G，H）。相比之下，1-NP组雌性胎鼠SVZ/VZ层GAD67+中间神经元增加（图3G，H）。先前的研究表明，小鼠中间神经元从GD14开始通过切线迁移到达额叶皮质。本研究在GD14检测到胎鼠前脑GAD67。虽然前脑GAD67蛋白在两组之间没有差异（图3I，J），但在1-NP暴露组胎鼠前脑中，前脑皮质的中间和远端（2和3区）GAD67+中间神经元减少（图3K，L）。

两组间共检测了12个中间神经元迁移基因。尽管Cxcl12、Cxcr4、Cxcr7、Slit1、Efna5、Arx、Nrp1、Nrp2和Sema3A没有差异（图3M-U），但Nrg1、Erbb4和Sema3F显示1-NP暴露的胎鼠前脑减少（图3V-X）。

图3 妊娠期1-NP暴露对胎鼠前脑中中间神经元迁移的影响

3 妊娠期1-NP暴露对胎鼠前脑中中间神经元迁移相关基因羟甲基化的影响

检测妊娠期1-NP暴露对GD14胎鼠前脑中间神经元迁移相关基因羟甲基化（5hmC）含量的影响。Nrg1、Erbb4和Sema3F基因的甲基化位点序列如图4A所示。虽然Nrg1和Erbb4基因的CpG富集片段的5hmC水平在两组中无差异，但在1-NP暴露的胎鼠中，Sema3F基因的一个CpG富集片段的前脑5hmC水平降低（图4B）。检测Nrg1、Erbb4和Sema3F基因CpG位点5hmC含量。如图4C所示，Nrg1基因CpG位点（位于chr1:32009246）的5hmC含量在1-NP组的胎鼠前脑中减少。Erbb4基因chr8:69107743和69107866两个CpG位点的5hmC含量在1-NP组的胎鼠前脑中降低。Sema3F基因3个CpG位点（chr9:107709269、107709348和107710238）的5hmC水平在1-NP组胎鼠中降低。检测胎鼠前脑中三种DNA去甲基化酶TET1、TET2和TET3的表达。虽然1-NP不影响TET1、TET2和TET3的表达（图4D-F），但1-NP组胎鼠的前脑TETs活性降低（图4G）。

图4 妊娠期1-NP暴露对胎鼠前脑中中间神经元迁移相关基因羟甲基化的影响

4 妊娠期1-NP暴露对胎鼠前脑线粒体功能的影响

为了探究1-NP诱导胚胎前脑中与中间神经元迁移相关的基因发生羟甲基化以及抑制TET酶活性的原因，作者对GD14胎鼠前脑进行了转录组分析。KEGG和GO分析发现1-NP引起前脑线粒体相关代谢功能障碍，如烟酸/烟酰胺代谢、类固醇生物合成和长链脂肪酸代谢（图5A，B）。基于KEGG的基因集富集分析（GSEA）显示，氧化磷酸化通路在1-NP暴露的胎鼠前脑中呈负富集（图5C）。基于GO的GSEA显示，暴露于1-NP的胎鼠前脑中电子转运链和氧化磷酸化通路呈负富集（图5D，E）。基于Reactome的GSEA显示，三羧酸循环和呼吸电子传递在1-NP暴露的胎鼠前脑中呈负富集（图5F）。此外，尽管线粒体面积没有差异，但在1-NP暴露的胎鼠前脑中，中间神经元的起源部位-神经节隆起区线粒体的嵴结构消失（图5G-I）。琥珀酸脱氢酶B和vATP5A，两个氧化磷酸化相关蛋白，在1-NP诱导的胎鼠前脑中下调（图5J-L）。后，在1-NP组中，胎鼠前脑中的异柠檬酸脱氢酶2（IDH2，线粒体α-酮戊二酸（α-KG）合成的关键酶）和α-KG（TET辅助因子）减少（图5M-O）。

图5 妊娠期1-NP暴露对胎鼠前脑线粒体功能的影响

5补充α-KG对1-NP引起的中间神经元迁移相关基因羟甲基化的影响

补充α-KG对1-NP引起的中间神经元迁移相关基因的低羟甲基化的影响见图6A-F。如预期，妊娠期补充α-KG抑制了1-NP引起的Nrg1基因CpG位点（chr1: 32009246）上5hmC减少（图6A）。此外，妊娠期补充α-KG预防了1-NP引起的Sema3F基因的一个CpG位点（chr9:107710238）5hmC减少（图6F）。在Erbb4或其他Sema3F CpG位点，补充α-KG对1-NP引起的5hmC减少具有保护趋势（图6B-E）。接下来，分析α-KG对1-NP引起的中间神经元迁移相关基因表达下降的影响。如图6G-I所示，妊娠期补充α-KG减轻了1-NP诱导的胎鼠前脑中Sema3F、Nrg1和Erbb4的减少（图6G-I）。

图6 补充α-KG对1-NP引起的中间神经元迁移相关基因羟甲基化的影响

6 补充α-KG对1-NP引起的后代孤独症样行为的影响

在雄性后代中评估妊娠期补充α-酮戊二酸对1-NP诱导的孤独症样行为的影响。结果表明，妊娠期补充α-KG可预防雄性后代的社会行为障碍（图7G）。妊娠期补充α-KG缓解雄性后代的社会新奇行为障碍（图7H）。接下来，作者评估了妊娠期补充𝛼-KG对雌性后代1-NP诱发的孤独症样行为的影响。结果表明，妊娠期补充α-KG对雌性后代的社会行为障碍有保护作用（图7I）。此外，妊娠期补充α-KG能够保护雌性后代的社会新奇行为障碍（图7J）。

图7 妊娠期补充α-酮戊二酸对1-NP诱导的孤独症样行为的影响

此外，在本研究中作者还评估了母体1-NP暴露对后代前额叶内侧皮质（mPFC）中微型抑制性突触后电流（mIPSC）的影响、对mPFC中GAD67+中间神经元的影响。而且分析了补充α-KG对1-NP引起的中间神经元迁移抑制的影响以及补充α-KG对1-NP引起的mIPSC传递紊乱的影响。

综上所述，本研究探讨了产前暴露于1-NP（一种代表性的硝基多环芳烃）对子代孤独症样行为的影响。当前的结果表明，产前1-NP暴露通过延缓中间神经元从神经节隆起向前脑皮质的切线迁移而导致孤独症样行为。此外，产前暴露1-NP通过改变胎儿前脑的表观遗传重编程下调中间神经元迁移相关基因。在机制上，产前暴露1-NP会破坏线粒体TCA和α-KG的合成。补充α-KG（线粒体TCA循环的中间产物）可改善中间神经元迁移相关基因的羟甲基化重编程。母亲补充α-KG可改善1-NP暴露后代的中间神经元迁移和孤独症样行为。

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