骨关节炎（OA）是一种退行性疾病，与软骨代谢紊乱、炎症和氧化应激显著相关。据估计，到2032年，45岁以上人群中OA的患病率将上升到29.5%。然而，由于对其发病机制的了解尚不清楚，OA的治疗仍然受到限制。因此，研究OA的发病机制以开发有效的治疗方法是十分必要的。

OA研究的新进展表明，OA易感基因的异常表观遗传改变与疾病的发生和进展有关，表明表观遗传机制在OA发病或进展中起着至关重要的作用。常见的表观遗传修饰，包括组蛋白修饰、DNA甲基化和非编码RNA调控在OA中被广泛研究。除了DNA上的可逆化学修饰外，RNA上类似的修饰也可能是基因表达的功能性介质，N6-甲基腺苷（m6A）修饰是研究深入的修饰之一。RNA的m6A修饰主要由m6A甲基转移酶（METTL3、METTL14、WTAP和VIRMA，称为写蛋白）驱动，被m6A去甲基化酶（FTO和ALKBH5，称为擦除蛋白）去除，并由m6A结合蛋白（IGF2BPs、YTHDCs和YTHDFs，称为读蛋白）识别。虽然这种修饰在各种疾病中逐渐被发现，并影响疾病的发展，但只有少数研究表明软骨细胞中的m6A甲基化可以影响OA的进展，如甲基转移酶METTL3。关于其它的m6A甲基化调控酶在OA中的作用的信息仍然缺乏。

2024年1月4日Experimental & Molecular Medicine（IF：12.8）杂志在线发表了南京鼓楼医院运动医学与成人重建外科蒋青教授及徐兴全团队新成果“WTAP介导m6A修饰FRZB通过Wnt信号通路在骨关节炎中引发炎症反应”。在这项研究中，团队研究了m6A写蛋白的作用，并探讨了其在人类骨关节炎软骨中的潜在机制。该研究结果首次揭示了WTAP是OA中甲基转移酶表达上调显著的，通过其m6A催化活性促进软骨细胞变性、炎症和氧化应激。重要的是，在体外和体内均发现WTAP表达降低可抑制Wnt信号激活，并通过降低m6A修饰的FRZB来缓解OA进展。

值得一提的是，天昊生物有幸参与了其中的m6A测序及分析工作，为其中寻找WTAP潜在靶点提供了协助。

主要研究结果

1.WTAP在临床骨关节炎软骨及TNF-α诱导软骨细胞中高表达

首先在临床OA软骨中检测主要m6A相关基因（METTL3, METTL14, WTAP, VIRMA, ALKBH5和FTO）的表达水平，发现WTAP是唯一显著上调的甲基化转移酶（图1a）。为了诱导OA细胞模型，用促炎细胞因子TNF-α处理人软骨细胞，OA样表型由软骨基质代谢基因（ADAMTS4, ADAMTS5, MMP13）、炎症基因（IL-6, IL-8, iNOS）mRNA（图1b）及蛋白水平（图1c, d）上调确认。TNF-α处理后反应性氧化物（ROS）水平上升，其与OA进展相关（图1e）。进而在OA细胞模型中确认m6A相关基因的表达，同样发现WTAP mRNA及蛋白水平上调（图1f-h）。这些结果表明WTAP在OA软骨中高表达，并且可能与OA进展相关。

图1 WTAP在TNF-α诱导的软骨细胞和OA软骨中上调

2.WTAP参与OA软骨细胞表型

为了确定WTAP在OA中的作用，用过表达WTAP的质粒转染软骨细胞。通过qRT-PCR和WB证实WTAP mRNA和蛋白水平升高（图2a-c）。免疫荧光检测结果也显示，软骨细胞中WTAP蛋白水平升高（图2d），WTAP过表达后m6A甲基化水平升高（图2e）。

为了评估WTAP对骨关节炎软骨细胞表型的影响，测定了ADAMTS4、ADAMTS5、MMP13、IL-6、IL-8和iNOS的mRNA表达水平（图2f），以及ADAMTS4、ADAMTS5和MMP13的蛋白表达水平，发现过表达WTAP后软骨细胞中这些蛋白表达水平显著升高（图2g, h）。与对照软骨细胞相比，过表达WTAP的软骨细胞中活性氧的产生显著增加（图2i, j）。

图2 WTAP过表达加重了TNF-α-诱导的骨关节炎软骨细胞表型

此外，用慢病毒转染软骨细胞敲除WTAP，TNF-α（50 ng/mL）处理对第7天的转染效率没有影响（图3a）。KO-WTAP细胞模型显示TNF-α处理下WTAP mRNA和蛋白水平显著降低（图3b-d）。免疫荧光结果也证实了转染WTAP慢病毒的有效性（图3e）。敲除软骨细胞中的WTAP可降低m6A水平（图3f），并显著降低OA细胞模型中关节炎相关基因的mRNA和蛋白水平（图3g-i）。综上所述，这些结果表明WTAP参与骨关节炎软骨细胞表型。

图3 敲除WTAP可减轻骨关节炎软骨细胞表型

3.OA软骨中FRZB m6A修饰增加

利用MeRIP-seq对临床OA软骨及未受伤软骨样本进行分析，以确定潜在下游靶点。与未受伤软骨相比，5706个基因存在m6A修饰差异（图4a）。其中，3886个基因存在上升的甲基化peak，主要富集在外显子区域及3’ UTR区（图4b）。另外，RNA测序显示675个上调基因及260个下调基因出现在OA软骨中（图4c, d）。为了发现富集的通路，利用STRING数据库分析top 200上调基因的相互作用网络（图4e）。GO分析结果显示m6A修饰基因与GO:0061037（负调控软骨发育）相关。FRZB表达下调为显著，在OA软骨中发现高的m6A修饰（图4f）。

为了证实FRZB在OA中的表达和修饰，研究检测了用DAA（一种特异性m6A甲基化抑制剂）处理的软骨细胞中FRZB的mRNA和蛋白水平。FRZB在DAA处理后表达上调（图4g, h），在OA细胞模型中观察到FRZB表达降低（图4i, j）。上述结果与MeRIP-seq和RNA-seq分析结果一致。

利用KEGG富集分析显示FRZB相关的Wnt/β-catenin通路在临床OA软骨中显著上调（图4k），这些结果说明WTAP可能介导FRZB的m6A修饰并通过Wnt/β-catenin通路调控OA软骨细胞表型。

图4 Wnt通路抑制剂FRZB的m6A甲基化修饰在OA中异常升高

4.WTAP通过FRZB激活Wnt/β-catenin信号通路

为了研究WTAP是否影响Wnt/β-catenin通路，在WTAP过表达（flag-WTAP）和WTAP敲除的软骨细胞中鉴定了FRZB和β-catenin的表达。在WTAP过表达软骨细胞中观察到FRZB表达减少，β-catenin表达增加（图5a-e），免疫荧光也证实了类似的结果（图5f, g）。相反，发现KO-WTAP中FRZB表达增加，β-catenin表达降低（图5h-l），免疫荧光结果也证实了这一点（图5m, n）。因此，这一研究结果表明WTAP可以通过抑制FRZB的表达来激活Wnt/β-catenin通路。

图5 软骨细胞中FRZB-Wnt/β-catenin轴受WTAP调控

5. WTAP通过m6A-FRZB/Wnt/β-catenin信号通路诱导骨关节炎软骨细胞表型

为了进一步确定骨关节炎软骨中WTAP介导的m6A-FRZB，使用甲基化抑制剂DAA来研究FRZB m6A修饰和Wnt/β-catenin在flag-WTAP软骨细胞中的激活。qRT-PCR和WB结果显示，经DAA处理后软骨细胞中FRZB mRNA和蛋白表达显著上调（图6a, b），而Wnt/β-catenin mRNA和蛋白水平受到抑制（图6c, d）。此外，观察到flag-WTAP软骨细胞在DAA处理后OA软骨细胞表型显著降低，包括关节炎相关基因mRNA及蛋白水平降低（图6e-g）。ROS染色显示经DAA处理的flag-WTAP软骨细胞中活性氧水平降低（图6h, i）。综上所述，这一研究结果表明，WTAP通过m6A修饰促进骨关节炎软骨细胞分解代谢，从而影响FRZB的稳定性。

图6 WTAP通过m6A修饰FRZB调节Wnt/β-catenin信号激活和骨关节炎软骨细胞表型

6. 沉默WTAP可通过Wnt/β-catenin信号通路缓解OA的发展

为了研究WTAP是否在体内OA进展中发挥作用，在DMM手术诱导的OA小鼠模型中关节内注射NC或腺相关病毒（AAV）siWTAP。Safranin O和快速绿色染色显示，AAV siWTAP处理DMM诱导的OA小鼠的软骨表面改善，而NC AAV没有改善（图7a）。定量分析OARSI评分显示NC AAV导致显著更高的分数，而siWTAP治疗降低了OARSI评分（图7b）。IHC结果显示OA小鼠模型注射AAV siWTAP减轻了软骨基质的退行性改变，如分解代谢反应，并增加细胞外基质组成（图7c）。

与体外实验结果一致，siWTAP使Wnt/catenin-β通路失活，通过抑制FRZB的表达改善骨关节炎软骨降解（图7d）。研究还注意到siWTAP对骨关节炎软骨和OARSI评分的这些保护作用通过SKL2001激活Wnt/β-catenin信号通路而被消除（图7a-d）。此外，通过开放场试验和足迹分析证实siWTAP抑制骨关节炎表型（图7e-g）。这些结果表明，β-catenin通路有助于WTAP刺激骨关节炎软骨的分解代谢变化和发育。

图7 WTAP抑制通过Wnt/β-catenin信号失活缓解OA进展。

总 结

当前的研究表明，WTAP依赖性RNA m6A修饰的升高加重了骨关节炎软骨的退变和进展。在机制上，WTAP以m6A依赖的方式稳定FRZB mRNA，并激活骨关节炎软骨细胞中的Wnt/β-catenin信号通路。这一发现说明由WTAP介导失调的RNA m6A修饰可能是OA治疗的一个有希望的治疗靶点。

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