抗生素的存在会抑制反硝化过程。研究抗生素胁迫下混合营养反硝化过程中反硝化性能的变化和抗生素的协同降解，将促进对海水养殖废水中硝酸盐和抗生素污染控制的理解。近期，来自中国海洋大学赵阳国和季军远老师课题组的科研人员在《Journal of Environmental Management》上发表论文。该研究利用天昊生物微生物16S扩增子测序技术，深入探讨了在抗生素磺胺甲噁唑（SMX）胁迫下，具有不同有机补充混合营养反硝化系统的性能。                             

英文题目：Impact of sulfamethoxazole and organic supplementation on mixotrophic denitrification process: Nitrate removal efficiency and the response of functional microbiota

中文题目：磺胺甲噁唑和有机补充对混合营养反硝化过程的影响：硝酸盐去除效率和功能微生物群的响应

期刊名：Journal of Environmental Management

发表时间：2022年10月15日

影响因子：8.910

背景简介

海水养殖在改善居民饮食结构和确保世界粮食安全方面发挥着至关重要的作用。在市场和环境需求的推动下，环保型循环水产养殖系统（RAS）被广泛用于海产品生产。在RAS中，硝态氮(NO3--N)是来自高蛋白饲料和生物粪便常见的终产品。由于低水交换率和高养殖密度，RAS中积累的NO3--N对水产养殖产品的健康和生长构成严重威胁。

中国每年生产约21万吨抗生素，终有25%~75%的抗生素直接排到水环境中。海水养殖废水通常含有大量抗生素。抗生素的滥用在很大程度上促成了抗生素耐药细菌（ARBs）的富集和抗生素耐药基因（ARGs）的转移。特别是ARGs向病原体的横向转移对陆生动物和人类健康构成威胁。因此，迫切需要处理海水养殖废水中的硝酸盐和抗生素。

异养反硝化（HDN）已广泛用于废水处理，其中异养反硝化需要大量有机碳（例如乙酸盐）作为电子供体来减少硝酸盐，此外，HDN会产生大量的碱，并且需要额外的成本来缓冲pH值的变化。相比之下，硫自养反硝化（SADN）以元素硫和还原硫化合物（如硫化物、硫代硫酸盐）作为电子供体，在反应过程中还原硝酸盐并产生酸，特别适用于处理低COD与总无机氮比（C/N）的硝酸盐污染废水。然而，硫的低生物利用度限制了其应用。同样，硫化物由于其生物毒性而被限制用于处理海水养殖废水。研究人员发现硫代硫酸盐比元素硫和硫化物更有效。为了结合SADN和HDN的优势，硫代硫酸盐和有机物同时驱动的混养反硝化系统正在兴起。

之前的研究表明，抗生素（如磺胺甲噁唑SMX）的存在会抑制反硝化过程。因此，研究抗生素胁迫下混合营养反硝化过程中反硝化性能的变化和抗生素的协同降解，将促进从理论研究向应用的转变。

因此，在本研究中，在SMX暴露量增加的情况下设置了四个实验室规模序批式反应器（SBR），即A-SBR（自养-SBR，C/N = 0），M0.7-SBR（混合营养型-SBR，C/N = 0.7），M2-SBR（混合营养型-SBR，C/N = 2）和M5-SBR（混合营养型-SBR，C/N = 5）。这项工作的目的是(1)探索反硝化过程在不同有机补充条件下的性能；(2)研究不同SMX胁迫对不同有机补充的反硝化体系脱硫性能的影响；(3)分析SMX 胁迫下反硝化速率和脱硫速率的变化；(4)揭示SMX胁迫下混合营养反硝化过程中的微生物群落结构。

研究方法

使用有机玻璃构建了四个工作体积为1L的实验室规模SBR，并用磁力搅拌器连续搅拌。反应器水力停留时间（HRT）为16小时。反应器接种了大约2.8 g MLSS/L污泥，污泥在实验室中培养了三个月。

根据SMX用量，将四台SBR的整个运行过程分为4个阶段，即I期至IV期（表1）。在第一阶段（第0-11天），四台SBR添加了海水养殖废水，没有添加SMX。在第二阶段（第12-21天），除了合成废水，SMX被添加到进水，终浓度为300μg/L。在第三阶段（第22-31天），将SMX的剂量提高到约1.5mg/L。在第四阶段（第32-37天），通过停止SMX剂量恢复系统性能进行了评估。在整个运行阶段，在SBR运行的不同阶段（第11、21、31和37天）从四个反应器收集污泥样品，以研究抗生素对不同有机物补充系统内微生物群落的影响；每天收集出水样品，用0.45μm 滤膜过滤，测定总有机碳（TOC）、硝酸盐、亚硝酸盐、氨氮、硫酸盐、硫化物、硫代硫酸盐和SMX的浓度。此外，还测量了进水和出水的pH值。

表1、设计不同阶段的实验。

本研究在第11、21、31和37天从四个反应器收集污泥样品，利用天昊生物16S扩增子测序（V4-V5区），对污泥样品微生物多样性进行分析，并对其代谢功能进行了预测。

研究结果

研究首先对SBR的性能进行了分析。结果发现反应器不同运行工况下的脱氮效果不同。当SBRs在不同有机负载下成功启动时，SMX胁迫对四个反应器的反硝化性能影响不大，而降低了M2-SBR和M5-SBR去除氨氮的效果。

研究后续对反应器不同工况下的硫氧化/还原效能进行了分析。结果表明硫酸盐的净产量随着有机添加量的增加而减少，四个反应器均明显产生了硫酸盐。该结果表明有机补充降低了SADN中硫酸盐的产生，表明硫自养反硝化细菌对反硝化的贡献减少（图1）。

图1、四种SBR在SMX胁迫和不同有机补充条件下硫氧化/还原产物的变化。（原文图2）

先前的研究证实，在SADN过程中产生了大量的硫酸盐并伴随着碱度的消耗。SADN或HDN对反硝化的贡献可以通过反应器内pH值的变化来表征。添加有机物减少了四个SBR的进水和出水之间的pH值差距。这是由于富含有机物的异养反硝化细菌产生了碱度，从而平衡了SADN过程中的酸。本研究结果发现，在SMX存在下，SADN细菌对反硝化的贡献大于异养反硝化细菌。

研究对SMX胁迫下无机氮硫化合物的变化进行了分析，在反应器Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期末，利用反应器污泥与人工海水养殖废水进行批次试验。反应中硝酸盐氮、亚硝酸盐氮和氨氮的变化如图2所示。当 C/N ≤ 2 时补充有机物可以提高反硝化速率，这意味着碳源的补充可以提供更充足的电子供体，提高 无机氮（TIN）去除率，促进反硝化过程。然而，在C/N为5时，反硝化速率下降，这归因于硫化物的产生和氨氮的积累。同时，C/N为5的反应器含有足够的电子供体，导致系统中残留大量TOC，促进了硫代硫酸盐的还原过程，产硫菌属逐渐占主导地位，从而抑制了反硝化过程。此外，在进水SMX浓度为300μg/L时，四个反应器中几乎没有亚硝酸盐积累。然而，当SMX从300μg/L至1.5mg/L时，反应过程出现大量亚硝酸盐积累，随着反应的进行终被消除，这表明反应器中的亚硝酸盐还原过程被SMX减弱（图2）。

图2、NO3--N 和 NO2--N (a, c, e) 和NH4+-N (b, d, f)在不同批次实验中的变化。（原文图4）

此外，对硫转化速率变化的研究发现，反硝化过程伴随着硫酸盐的产生，这进一步证实了即使在SMX胁迫下SADN仍在反硝化中发挥重要作用。但随着反硝化的完成，系统中残留的硫代硫酸盐会被继续消耗而产生硫化物。

后，本研究对微生物群落的多样性和群落演替进行了分析。有机物的补充和SMX的添加均显著影响了微生物群落结构。门水平上微生物群落的相对丰度表明，变形菌门和拟杆菌门在所有污泥样品中占优势。除A-SBR外的其他反应器中，SMX胁迫增强了变形菌门的相对丰度，降低了拟杆菌的相对丰度。此外，更多的有机物补充会使变形菌门中微生物的多样性更高。

属水平上微生物的演替表明，在A-SBR体系中，优势属为Sedimenticola和Thiogranum。其中，Sedimenticola能够通过使用硫化物、硫代硫酸盐和硫单质作为电子供体进行反硝化。Thiogranum也被确定为化能自养的硫氧化细菌。当存在300μg/L SMX时，Sedimenticola的相对丰度从11.7%增加到15.7%。随着SMX浓度的进一步增加，Thiogranum的相对丰度从15.5%增加到25.4%。同样地，Winogradskyella和Marinicella的相对丰度随着抗生素浓度的增加而提高。然而，Melioribacter的相对丰度下降。

与A-SBR相比，M0.7-SBR体系中Sedimenticola的相对丰度仍然较高，但Thiogranum的相对丰度明显降低。SMX的添加导致了Sedimenticola富集。M2 -SBR包含与A-SBR和M0.7-SBR相似的优势属。随着SMX用量的增加，脱硫菌在周期Ⅱ的相对丰度升高。

与上述反应器不同的是，M5-SBR在周期Ⅰ的种属构成以Sedimenticola、Thiogranum和Winogradskyella为主。随着SMX用量的增加，Winogradskyella的相对丰度降低，而Desulfurocapsa、Desulfuromusa和Desulfobacter的相对丰度增加。它们的高丰度为这一阶段的硫化物生产奠定了基础。另外，在 SMX 胁迫下，该反应器中存在的Marinobacter和Sulfurovum的相对丰度升高（图3）。

图3、四个生物反应器污泥样品中属水平上微生物群落的组成和演变。（原文图6）

通过对微生物16S扩增子测序结果分析，文章还展示了KEGG途径中与氮代谢和硫代谢相关的基因丰度。随着C/N的增加，参与氮代谢的基因的相对丰度总体上增加。然而，将C/N增加到5反而降低了参与氮代谢的基因的丰度。SMX浓度的增加降低了与氮代谢相关的基因丰度，这个变化趋势与反应器中检测到的反硝化菌丰度变化一致。

此外，基于PICRUST2，对KO途径的预测功能基因数据进行筛选和可视化，得到所有样本的氮代谢和硫代谢相关基因的两张热图（图4）。高丰度的编码同化硝酸盐还原（ANR）、异化硝酸盐还原（DNR）、反硝化基因和编码硝酸还原酶/亚硝酸氧化还原酶的多功能基因表明SBR中的污泥具有很强的反硝化能力。此外，A-SBR中编码hao（羟胺氧化还原酶）的基因的高丰度证实了氨氮的快速去除。SMX胁迫提高了编码DNR基因的丰度，解释了该阶段氨氮的积累现象。有机补充使有关硫氧化和硫还原的基因丰度增加。特别是，与硫还原有关基因的丰度在SMX胁迫下更为丰富，这与SBR中产硫细菌的丰度增加直接相关。

图4、基于PICRUST2预测的所有污泥样品中与(a)氮和(b)硫代谢相关的功能基因。（原文图S9）

研究结论

当C/N比为5时系统内将残留较高浓度的硫代硫酸盐，并且在1.5 mg/L的SMX胁迫下存在DNRA过程。此外，SMX胁迫促进了硫代硫酸盐向硫化物的转化，降低了异养反硝化细菌的相对丰度，使硫自养反硝化细菌对反硝化的贡献更高。同时，进水C/N≥0.7时，SMX导致具有产硫化物功能的菌属的相对丰度增加。1.5 mg/L的SMX在C/N为5时引起氨的积累。批次实验进一步表明，当C/N≤2时反硝化速率加快，而当C/N为5时反硝化速率下降。结合上述结果，混合营养反硝化以0.7的C/N启动的系统似乎表现出好的脱氮和脱硫性能，并显示出对SMX佳的抵抗性。总体而言，该研究表明，在SMX胁迫下，具有不同有机补充的混合营养反硝化系统的性能可以为优化海水养殖废水处理工艺提供有价值的信息。

• 祝贺！天昊扩增子测序助力滴灌土壤细菌真菌研究登陆一区Top杂志《Agricultural Water Management》;
• J Environ Manage. | 天昊微生物功能基因扩增子测序在生物炭治理土壤磷流失研究中取得新成绩;
  
• Front Microbiol. | 天昊专利技术Accu16S细菌绝对定量测序在荔枝园种植领域取得新进展；
  
• 盘点 | 天昊生物专利技术--Accu16S细菌和AccuITS菌绝对定量测序客户文章汇总（环境农学篇）；
  
• 盘点 | 天昊生物专利技术--Accu16S细菌与AccuITS真菌绝对定量测序客户文章汇总（医学篇）；
  
• 盘点 | 天昊微生物组（扩增子/宏基因组）+代谢组客户高分文章（医学/食品/农学）；
  
• 恭喜！天昊16S扩增子助力益生菌肾病治疗研究登陆一区Top杂志《Circulation Research》（IF 23.213）；
  
• 喜讯！天昊微生物项目文章登陆国际期刊《Advanced Science》；
  
• 喜讯！天昊Accu16S细菌绝对定量技术助力客户股骨头坏死研究登陆Science子刊《Science Advances》；
  
• 喜讯！天昊微生物项目文章登陆国际精神疾病领域期刊《Molecular Psychiatry》；
  
• 再发“昊”文！天昊微生物项目文章登陆肠道微生物领域期刊《Gut Microbes》；