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近有不少研究人类和动物“肠-脑轴”的老师咨询，通过微生物扩增子、宏基因组以及非靶向代谢组学，找到了与疾病关联的关键细菌和代谢物，后续应该如何设计实验，进一步确定因果关系？11月刚刚发表在Nature Protocols杂志上的文章，利用体外、体内模型实验和靶向代谢组方案进行了优化，提出了包含体外（类器官）和体内小鼠模型系统代谢物综合评估的策略。
该策略主要包括三个阶段：（阶段1）微生物在确定培养基中的生长；（阶段2）显微注射肠道类器官；和（阶段3）建立动物模型，包括无菌小鼠（GF，无微生物），无特异性病原体小鼠（SPF，完全肠道菌群）和无特异性病原体的重新常规化小鼠（与来自SPF小鼠的完整肠道菌群相关的GF小鼠），以及Bifidobacterium dentium（齿状双歧杆菌）和Bacteroides ovatus（卵形拟杆菌）单菌相关小鼠（单个肠道微生物定植的GF小鼠）。通过基于靶向代谢组学方法，分析来自这些样品微生物衍生的短链脂肪酸和神经递质。与通常仅检查粪便样本的方案不同，该方案还包括细菌培养物、类器官培养物和体内样本，使结果更具说服力。
英文题目：Interrogation of the mammalian gut–brain axis using LC-MS/MS-based targeted metabolomics with in vitro bacterial and organoid cultures and in vivo gnotobiotic mouse models
中文题目：使用基于LC-MS/MS的靶向代谢组学，通过体外细菌和类器官培养以及体内无菌小鼠模型，对哺乳动物肠-脑轴进行研究
期刊名：Nature Protocols
发表时间：2022年11月9日
背景介绍
胃肠道拥有丰富多样的微生物群落，统称为肠道菌群。肠道菌群包括厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形杆菌门和疣状菌门等。在人类中，肠道菌群在出生后不久发育，并随着宿主年龄的增长而波动。在发育早期，婴儿肠道通常以放线菌门的双歧杆菌为主，出生后肠道菌群在肠道的定植与大脑中神经回路的组织相吻合。因此，在这个重要窗口期间微生物和宿主之间的相互作用被认为对适当的中枢神经系统（CNS）发育至关重要。微生物组结构在生命早期发生变化，随着时间的推移，多样性和稳定性缓慢增加。青春期后，肠道微生物组逐渐稳定，以细菌门和厚壁菌门为主。衰老过程中这些成分的变化被认为是自然和良性的，可能代表了饮食、环境和宿主潜在需求的变化。
除了在维持肠道环境方面的作用外，肠道微生物因其对其他远端器官的影响而越来越受到认可。在过去的十年中，研究人员开始认识到胃肠道和大脑之间重要的双向联系，称为肠-脑轴。微生物定植和微生物代谢物，与肠道和大脑中神经递质的水平和周转以及动物行为有关。肠道微生物可以通过多种途径与大脑沟通：细菌代谢物（例如短链脂肪酸（SCFA）和肽聚糖）与神经递质的产生（例如γ-氨基丁酸（GABA）、组胺）、色氨酸代谢、肠内分泌细胞活化、免疫调节以及肠道神经系统（ENS）和迷走神经的刺激。肠道微生物组与焦虑、肥胖、自闭症、精神分裂症、帕金森病和阿尔茨海默病之间的联系突显了微生物在中枢神经系统中的作用。动物模型在将微生物与这些基本神经过程联系起来方面至关重要。然而，目前的大部分工作都集中在复杂的微生物群落上，这使得很难确定哪些微生物物种驱动宿主中特定的CNS改变。因此，需要具有更高精度的模型来解决这些不足。
策略制定
本研究试图使用基于靶向液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的代谢组学方法来解决这一问题，该方法使用体外（培养基和类器官模型）和体内（用单个微生物定植的gnotobiotic悉生小鼠）系统检测细菌代谢物并量化宿主来源的神经递质和SCFA。为了展示这种策略，本文选择两种在人类肠道菌群中常见的共生微生物：齿状双歧杆菌和卵形拟杆菌。我们以前曾使用与这些细菌物种结合的无菌（GF）小鼠（也称为悉生小鼠）来表征与齿状芽孢杆菌和卵形双歧杆菌相关的SCFA和神经递质水平。使用微生物培养物和悉生动物，发现齿状芽孢杆菌产生GABA，GABA调节肠道粘液产生和内脏敏感性。体内实验表明，齿状芽孢杆菌定植与肠道血清素水平升高相关，并且双歧杆菌分泌的化合物（如乙酸盐）刺激肠嗜铬细胞在肠类器官中的体外释放血清素。本策略通过与模型（化学定义的细菌生长培养基，类器官和悉生动物）的结合，来剖析单个微生物对宿主神经递质水平的贡献。
方案概述
在该方案中，作者展示了一种基于系统的方法来确定特定细菌如何改变肠道和中枢神经系统。图1描述了用于制备本方案中研究的不同类型的微生物组模型的一般工作流程图，由以下三个部分组成：（阶段1）使用培养基生成微生物代谢物，以鉴定任何微生物衍生的神经递质和SCFA（步骤1-24）；（阶段2）使用小鼠或人类器官体外研究微生物代谢物对肠上皮的影响，以确定肠上皮产生神经递质的小肠内分泌细胞如何对细菌产物作出反应（步骤25-47）；（阶段3）使用单个微生物定植的悉生小鼠进行体内研究，以确定肠道和大脑如何对微生物定植做出反应（步骤48-52）。文章后续步骤详细描述了悉生小鼠粪便样本收集、动物安乐死（步骤53-56），以及收集和处理各种组织（包括脑组织（步骤57-69）、肠内容物（步骤70-79）和粪便（步骤80-86）的步骤，然后将悉生小鼠与GF小鼠和具有完整微生物群的SPF重新常规化小鼠进行比较。
图1、用于制备本方案中研究的不同类型的微生物组模型的一般工作流程。第1阶段重点介绍了如何使用初级微生物培养物生产的体外培养微生物培养基样品，以及如何在下游使用这些相同的培养物来生成第2阶段（肠类器官的体外显微注射）和第3阶段（制备悉生小鼠和SPF重新常规化小鼠）中描述的其他肠脑轴模型。
这些方法可以单独使用，也可以组合使用。例如，通过LC-MS/MS分析无细胞微生物条件培养基可以为比较各种细菌菌株产生的SCFA和神经递质提供高通量方法，并可用于选择佳微生物候选物进行下游分析。微生物条件培养基方法还可以提供有价值的信息，帮助确定在体内关注哪些特定途径，并且可以为哪些SCFA和神经递质可能是微生物或宿主衍生提供独特的见解。使用肠道类器官的优点是它们含有天然肠道上皮的所有不同细胞类型，包括产生激素的肠内分泌细胞。肠道类器官可分泌多种神经递质，包括血清素、葡萄糖依赖性促胰岛素多肽、肽YY和生长素释放肽。因此，研究人员可以使用肠道类器官来检测肠内分泌细胞中微生物刺激的神经递质释放。该模型仅包含上皮，这使得研究人员能够在没有肠神经系统的情况下解决肠内分泌释放激素的作用，肠道神经系统可以分泌类似的神经递质。悉生动物是模型为单个微生物影响宿主健康的机制提供了新的信息。这些模型为微生物-宿主相互作用提供了整体方法，并提供有关肠-脑轴的信息。在我们看来，还原论者体外微生物条件培养基和类器官模型可以帮助完善假设并专注于体内动物模型工作。
图2显示了样品类型和基于SCIEX QTRAP 6500的LC-MS/MS平台的概述。在该方案中，文章描述了以下样品的收集：（1）包括代谢物的无细胞微生物条件培养基（步骤9-14用于微生物培养和条件微生物培养基处理，步骤87B（i-iii）用于色氨酸和酪氨酸途径，以及谷氨酸循环分析，以及步骤87A（i-v）用于培养基中的SCFA分析）；（2）来自类器官的培养基，显微注射含有代谢物的无细胞微生物条件培养基（步骤25-47）；（3）肠道冲洗（步骤53-54、56和70-79）；（4）脑匀浆（步骤53-54、56和57-69）；（5）粪便样本（步骤53-55、80-86和附加步骤87A（i-ii）和（vi-viii），用于均质粪便样本提取物中的SCFA分析）。图3a突出显示了正在研究的神经递质的代谢途径，以及使用基于LC-MS/MS的方法为这些途径生成的相应色谱图。图3b的左侧确定了SCFA分析物的衍生化前和衍生化后结构的化学结构以及用于进行衍生化反应的试剂。图3b的右侧显示了使用所述LC-MS/MS方法为这些衍生化代谢物生成的代表性色谱图。
图2、每种样品类型的样品收集方法和处理流程。用于分析本方案中描述的五种不同样品类型的工作流程。这些程序包括以下内容：（1）制备无细胞微生物培养基样品，（2）制备无细胞类器官培养基，（3）收集和提取肠冲洗样品，（4）均质化和提取收集的小鼠脑组织，以及（5）均质化和提取收集的小鼠粪便样品。
图3、该方案中介绍的部分代谢途径和基于LC-MS/MS的色谱图。a，每个神经递质途径研究及色谱数据。b，左：SCFAs的化学结构，使用的衍生化试剂和衍生化的SCFA-analide反应产物（标记A-G）。右：使用所述LC-MS/MS方法（标记A-G）的SCFA-analide衍生物色谱峰。
替代方法、优势和应用
大多数使用小鼠检测肠脑轴的研究都使用具有完整肠道菌群的SPF小鼠。然而，肠道菌群的复杂性使这些研究难以解释。悉生动物为单个微生物在肠脑信号传导中的作用提供了令人信服的证据。小鼠与多种微生物单相关，包括拟杆菌属、埃希里氏菌属、瘤胃球菌属、玫瑰花属、乳酸杆菌属、双歧杆菌属和分段丝状菌属。该方案中使用的单关联技术与其他单关联研究非常相似，通过口服饲养法将单个微生物引入维持在无菌隔离器中的GF小鼠。然而，这些单相关小鼠的下游应用因实验设计而异。到目前为止，只有少数研究使用单相关小鼠来检查肠道和大脑中的神经递质水平。本文描述了基于LC-MS/MS的方案，用于分析用单一微生物物种定植的悉生动物模型中的肠道和脑神经递质以及SCFA，它们使我们能够解决特定微生物对肠道和大脑的影响问题。
除了使用单相关动物的研究外，还可以生成具有定义微生物群落的悉生模型。这些群落可能由几种相关的菌株组成。这些发现可以补充单关联模型，以帮助确定单个微生物中特定代谢途径的存在与否如何促进菌群，并确定哪种微生物和/或微生物组合驱动特定表型。此外，悉生小鼠可以用人类粪便样本（健康和患病）定植，并且可以分离感兴趣的微生物并用于单关联研究。根据问题的不同，GF小鼠也可以从转基因小鼠中产生并用于单关联研究。
这里描述的方法的优点之一是使用化学定义的细菌培养基。在该方案中，我们使用了ZMB1，这是一种培养各种微生物（双歧杆菌，拟杆菌，链球菌，乳酸杆菌，乳球菌，梭状芽胞杆菌等）的培养基，并且适用于基于LC-MS/MS的代谢组学分析。
涉及微生物-宿主相互作用的研究近随着类器官培养系统的进步而扩大。类器官，也称为类肠或结肠类，来源于供体肠道组织，与传统的癌症来源或永生化细胞系相比，具有几个关键优势。这些优点包括：（1）保留区段特异性；（2）所有肠细胞类型的表达；（3）产生肠粘液层；（4）干细胞的维持；（5）激素分泌。使用类器官模型，我们可以开始剖析微生物和宿主上皮之间的信号传导，特别关注上皮肠内分泌激素。本方案中描述的体外技术可用于所述初级类器官（从组织部位分离），以及来源于多能干细胞或胚胎干细胞的类器官。这些多能和胚胎干细胞培养物可用于生成多种组织类型，包括胃肠道和大脑类器官。此外，类器官可以从健康个体或特定的患者群体中产生。因此，这些类型的研究适合解决与微生物-宿主相互作用相关的众多问题。
本文描述的靶向代谢组学方法提供了解析共生微生物与宿主之间复杂的双向相互作用所需的分析工具套件。这些方案可以很容易地适应各种各样的细菌，包括共生和致病微生物。使用微生物代谢物，类器官和悉生小鼠，研究人员可以特异性地识别微生物信号（体外和体内），并将它们与宿主内的变化联系起来。这些发现可用于开发设计微生物混合物，以开发下一代益生菌。将来，这些方案也可用于检查神经系统疾病的微生物基础。
局限性
本方案的一个潜在局限性是缺乏用于检查肠道神经系统的体外系统，这是神经递质的另一个生产者。然而，我们的类器官系统适合与原代肠神经元或分化为肠神经系统细胞的干细胞共培养，或者肠神经系统细胞可以直接与我们的细菌条件培养基一起孵育。除了肠道神经系统，免疫系统也被推测在肠脑轴中起主要作用。存在免疫细胞和肠道类器官的共培养模型，我们的细菌培养物可以与免疫细胞/类器官共培养物一起孵育。
使用GF小鼠的一个缺点是GF动物有免疫缺陷，例如免疫教育受损。这个问题的替代方案是将怀孕的母体单体关联，以便选定的微生物指导后代的免疫系统。尽管单相关小鼠提供了对单个微生物功能的独特见解，但微生物并不孤立地存在于肠道中。作为一种替代方法，悉生动物可以与复杂的微生物群落一起定植，这些微生物群落更紧密地反映了肠道的原生环境。基于我们对微生物如何交流（即群体感应和外膜囊泡）、维持生态位（即抗菌药物产生和pH波动）和交叉喂养的现有知识，我们不希望单独生长的微生物的行为与它们在复杂的微生物群落中的行为完全相同，并且定义的群落可能更能反映体内的肠道。例外情况可能发生在低生物量时期，例如类似于早期生命发育或抗生素治疗后的时期。在这种情况下，我们推测单一物种分析可能更具预测性。
GF小鼠的背景，年龄和性别也可以变化，并且某些微生物可能无法定植来自其他遗传背景的小鼠或高龄小鼠。使用目前的方法，很难测量复杂生态系统中单个微生物的功能。未来，我们计划创建具有小重叠功能的设计群落，并进行稳定标签同位素追踪实验，以破译复杂的微生物-微生物代谢相互作用。然后，这些类型的实验可以应用于多种疾病，如阿尔茨海默氏症、痴呆、抑郁症和焦虑症。
根据定义，基于三重四极杆质谱仪的靶向代谢组学方法仅限于监测其分子特异性原始离子到产物离子跃迁被编程到基于选择反应监测（SRM）或多反应监测（MRM）的采集方法中的化合物。因此，分析人员可能需要付出相当大的努力来优化提取和LC-MS/MS方法，以适应在靶向代谢组学方法中添加哪怕是单一化合物。在时间要求方面，SCFA衍生化程序需要一整天（每位分析人员~6小时）来制备一次性衍生化和淬灭溶液，并等分和衍生化100个样品。此外，该程序需要使用含有剧毒物质EDAC，2-巯基乙醇和苯胺的浓缩溶液；只有经过适当培训和经验丰富的分析师才能处理这些化合物和溶液。后，该过程的成功执行需要敏锐地观察溶液添加顺序和衍生化和淬灭反应的时间；否则，SCFA分析物的衍生化可能无法启动或完成，或者可能过早淬灭。由于SCFA是挥发性的低沸点分析物，因此每个微生物组样品的等分试样应在第一个解冻循环后进行SCFA衍生化程序。强烈建议将每个微生物组样品以~100μL体积等分到几个一次性试管中，并在样品制备前冷冻。
应该注意的是，采用气相色谱-质谱（GC-MS）或基于GC-MS/MS的方法可以规避上述几种SCFA方法的局限性。文献中描述了许多可行的基于GC-MS的方法，这些方法可能是本文所述的基于LC-MS/MS的方法的合适替代方案。此外，我们还承认，一些实验室可能希望测量比该方法目前使用单一靶向LC-MS/MS的代谢组学方法提供的更广泛的微生物衍生代谢物群。或采用混合GC-MS和LC-MS的靶向代谢组学方法的生物分析工作流程来执行靶向测量。
试验设计
微生物代谢物的生产
细菌可以从供应商处购买，也可以根据机构审查委员会批准的方案从临床环境中获得。在每次实验期间，应使用分光光度计通过检查600nm处的光密度，并使用40×或60×物镜在显微镜上检查微生物形态。应常规检测微生物是否受到革兰氏染色的污染，并在选择性培养基上培养。虽然厌氧菌可以在短期内使用预还原的Hungate管或带有预还原培养基的气包进行培养，但我们建议在厌氧室中培养厌氧细菌。兼性厌氧菌可以有氧或在减氧条件下生长（例如，带有厌氧气体的容器系统产生小袋或蜡烛罐）。然而，兼性厌氧菌表达的特定代谢途径可能受到其培养的大气条件的影响。对于厌氧微生物，必须预先还原化学成分明确的培养基以支持生长。为了使组之间的微生物代谢物标准化，我们建议收集无细胞微生物条件培养基，该培养基含有在同一培养基中产生的代谢物，在相同的孵育条件下，在通过OD监测的特定细菌生长阶段600nm随着时间的推移。
微生物选择、小鼠品系、定植验证和体内生物研究的样品收集
单相关悉生小鼠的制备需要GF动物设施。这可能并非在所有机构都具备。SPF重新常规化的小鼠也需要特定培养室，尽管这些设施在大多数学术机构都可以使用。选择感兴趣的细菌是实验设计的另一个关键组成部分。大多数肠道微生物似乎定植于GF小鼠。然而，微生物在非自然宿主中的定植效率可能会有所不同，需要定期检查微生物定植状态以确保成功定植。我们建议从隔离器内的笼子中收集粪便，提取基因组DNA并通过PCR确认所选微生物的存在。作为对照，应包括其他微生物的序列，以确保没有污染。粪便也可以均质化，粪便微生物可以在选择性琼脂上生长，并检查菌落形成单位（CFU）以确认定植和活力。后，可以直接对粪便进行16S rRNA测序，以确认微生物谱。
另一个重要的考虑因素是实验中使用的小鼠品系。我们已经成功地定植了雄性和雌性成年Swiss-Webster和C57B6/J小鼠，并且该方案针对这些品种的小鼠进行了优化。某些微生物可能无法定植来自不同遗传背景的小鼠或高龄小鼠，在选择小鼠模型时，这些注意事项很重要。在该方案中，我们选择了远交的Swiss-Webster GF小鼠，因为它们的产仔数大，具有出色的培育能力。远交小鼠的遗传变异增加，这比近交系更准确地反映了人类种群的遗传结构。使用远交小鼠的一个警告是，小鼠之间的差异更大。这种动物变异可以通过使用近交小鼠来小化。此外，更多的遗传敲除/敲入模型可用于近交系，如C57BL/6J。因此，重要的是要考虑哪种小鼠品系适合解决感兴趣的科学问题。
后，重要的是要考虑悉生动物的微生物定植持续时间。在该方案中，我们提供了来自成年悉生小鼠的示例数据（图4和5），用齿状芽孢杆菌或卵形双歧杆菌定植17天。然而，这些方案可以适应更长或更短的定植时间。我们建议进行每组至少4只小鼠的预实验研究，以确定定植水平以及神经递质和SCFA浓度变化的稳健性。
图4、代表在体外培养基和体内粪便样品中测量的SCFAs绝对浓度的热图。a，对从化学定义培养基ZMB1中生长的齿状双歧杆菌和卵形拟杆菌厌氧培养物中收集的无细胞条件微生物培养基中的SCFA浓度进行定量。b，对已知粪便（ng / mg湿粪便重量）粪便样品提取物中的SCFA浓度进行定量，反映从GF、SPF重新常规化和单相关悉生小鼠收集的粪便中存在的SCFA浓度。
图5、表示在体外培养基和体内组织样品中测量的色氨酸、酪氨酸和谷氨酸循环途径中代谢物绝对浓度的热图。a，从在化学定义培养基ZMB1中生长的齿状双歧杆菌和卵形拟杆菌的厌氧培养物中收集的无细胞条件微生物培养基。b，从注射有牙状芽孢杆菌和卵形芽孢杆菌条件微生物培养基的肠道类器官中收集的培养基上清液。c，来自SPF重新常规化的GF和单相关悉生小鼠的肠道内容样品提取物。d，来自SPF、GF和单相关小鼠的匀浆脑组织提取物。这些实验强调了不同样本差异中神经递质水平的变化，以响应定植状态。
在该方案中，我们描述了冷冻粪便颗粒的使用。粪便含有水分，但水分含量因饮食、纤维摄入量、水合作用和遗传而异。在该方案中，从我们的动物组中收集的粪便颗粒的重量大致相同，并且没有观察到粪便稠度的差异。根据这些观察结果，粪便样品的含水量没有被去除。然而，当专门比较饮食或其他产生粪便含水量差异的变量时，重要的是在分析代谢物之前通过冻干去除水分。此外，在腹泻的情况下，清除粪便中的水分可能很重要。已知这些条件会影响粪便水量，因此可能会无意中改变下游分析。粪便冻干的一个警告是样品基质中挥发性SCFA的潜在损失。因此，我们仅在预计粪便重量因组而异的环境中冻干粪便。
肠道类器官和培养形式的选择
由肠道干细胞产生的组织来源类器官可以分化以包含与它们来源的胃肠道段相关的所有细胞类型。例如，从结肠收集的活检或组织将含有干细胞、肠内分泌细胞、肠细胞和杯状细胞。相比之下，从小肠（十二指肠、空肠或回肠）收集的活检或组织将含有干细胞、肠内分泌细胞、肠细胞、杯状细胞、胰腺细胞和簇状细胞。使用类器官系统的独特优势是它们保留了其片段特异性，并且片段在细胞类型、转运蛋白、粘蛋白分泌、激素分泌和功能方面有所不同。因此，重要的是要考虑要在研究中反映哪个部分。肠道类器官可以来源于各种动物（小鼠、猪、牛、马等）和人类。因此，该系统提供了在多个物种之间进行比较的能力，以及在小鼠和人类之间进行直接比较的能力。肠道类器官也可以由具有特定疾病表型的个体产生。这在转化应用方面提供了优势。
类器官可以以不同的培养形式进行维持；小鼠和人肠道类器官可以在3D或2D中培养。3D形式容易培养，类器官的内腔可以用微生物或微生物代谢物显微注射以模拟肠道环境。显微注射平台已被证明可以在3D类器官模型中创建稳定的厌氧微生物群落。为了规避显微注射的要求，可以在传代后将微生物添加到类器官培养物中。传代破坏类器官结构，然后随着类器官的重组，微生物被困在腔内。然而，这个过程导致变异性增加，因为很难控制每个类器官接收的微生物负荷。微生物或代谢物也可以添加到3D类器官的外部（基底外侧）。该方法不允许靶向存在于顶膜上的微生物受体，并且可能不会产生生物学相关的信号级联反应。此外，类器官可以在基质胶外培养，其中类器官固有地反转其结构，暴露顶端表面。在这种情况下，微生物或微生物代谢物可以直接添加到培养基中并与顶膜相互作用。这种“由内而外”的方法非常适合研究兼性厌氧菌和微生物代谢物，但如果没有专门的设备，就无法维持厌氧细菌。
除了3D格式外，类器官还可以作为2D单层生长。来自肠道的人类器官很容易在基质胶包被的孔和透孔上形成汇合的单层。然而，小鼠肠道类器官需要在跨孔板上具有气液界面以形成适当的单层。在该系统中，顶膜朝上使其易于用微生物或代谢物处理，并且随着时间的推移可以对培养基进行采样。使用2D类器官单层的一个实际警告是试剂成本的大幅增加，因为它们需要几个3D类器官孔来产生单个单层。此外，在没有额外的专用设备的情况下，Transwell板上的类器官单层无法长时间维持厌氧细菌。我们已经成功地使用显微注射的3D小鼠和人类类器官，并用细菌代谢物处理2D类器官单层来测量响应牙状芽孢杆菌的血清素释放。我们选择添加无齿状芽孢杆菌微生物条件培养基而不是活细菌，因为这种方法不需要任何专门的设备来创造厌氧环境，并且不需要监测细菌活力。格式的选择取决于下游应用程序。我们建议在更容易获得的小鼠类器官上使用2D跨孔单层进行试点研究。在2D跨孔单层形式中，细菌代谢物可以很容易地应用于顶膜，并且顶端和基底外侧释放的神经递质都可以通过LC-MS/MS检查。我们还建议检查从不同肠道区域（十二指肠、空肠、回肠、近端结肠和远端结肠）分离的类器官的神经递质谱，以响应选定的感兴趣微生物。
靶向代谢组学方法基准评估
本文对描述的所有四种靶向代谢组学方法进行了一维方法基准评估。在此测试期间评估的分析品质因数包括校准曲线线性测试、校准曲线动态范围内的精密度和准确度评估，以及这些方法中包含的所有23种代谢物的检测限（LOD）/定量限（LOQ）测定。在基准评估的早期确定，即使是不含酪氨酸、色氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和乙酸的改性ZMB1培养基质，仍然表现出高化学背景，干扰了几种代谢物在质量控制（低校准标准品（QC-LCS）和QC-低水平下的定量。制备一种新的小培养基，评估是否存在背景干扰，并用作制备校准标准品（校准品）和QC样品的代理矩阵，以进行精密度和准确度测试。补充方法中描述了小培养基制备。本文列出了谷氨酸循环法、SCFA法以及色氨酸和酪氨酸途径法的这些数据汇总表，整个方法基准数据以表格形式列出。在该方案中，我们描述了ZMB1中SCFA和神经递质的分析一种可以培养多组生物体的明确培养基。其他化学定义培养基，例如乳酸菌定义培养基（LDM4）或化学定义小培养基（CDMM）也可用于此类分析。
基于 LC–MS/MS 的生物分析
在开始运行之前，我们为代谢组学方法设置LC-MS/MS系统的方法遵循以下程序：（1）将液相色谱（LC）泵和自动进样器洗针（NW）溶剂管路放入含有适用于该方法的流动相和NW溶液的溶剂储液槽中，吹扫液相色谱泵至少5分钟，并通过NW管路手动吹扫至少50 mL溶剂，以便系统（步骤88-89）；（2）为方法连接适当的保护柱和分析柱（步骤90）；（3）打开LC-MS/MS系统并使用适当的采集方法平衡系统，同时监测分析柱的柱炉温度和操作背压（步骤91-92）；（4）使用低水平校准品或QC标准品进行一系列系统适用性进样（即同一样品的三到六次重复进样），以确认系统灵敏度、自动进样器进样重现性（即计算一系列进样的峰面积的方差系数（%CV））和目标代谢物的适当色谱保留时间，并进行残留评估（步骤93-95）。
每个分析批次的典型样品布局包括3-6个系统适用性样品的进样顺序，然后是溶剂空白样品、空白IS对照样品以评估IS溶液污染。空白IS对照样品后，按从低浓度到高浓度的顺序一式三份进样全系列校准品，并在高校准品序列之后进样溶剂空白以评估系统残留。然后根据批次大小，大约每五次或十次进样一次，向生物样品进样溶剂空白。
我们定量色氨酸和酪氨酸途径代谢物的靶向方法均基于离子对反相色谱分离，使用含有七氟丁酸作为离子对改性剂的流动相（图3a）。谷氨酸循环法基于HILIC，使用含有甲酸铵和甲酸的流动相进行流动相缓冲（图3a）。后，我们的SCFA方法利用联苯分析柱的芳族官能度与衍生化步骤中产生的SCFA-苯胺衍生物上存在的芳环之间的π-π堆积相互作用，以简单的梯度分离所有SCFA衍生物（图3b）。所有方法均能为保留因子（k′）检测的所有代谢物提供合适的色谱品质因数，通常为>3;峰值不对称性（As）通常接近1;大多数代谢物关键对是基线分离的（图3a，b）。
LC–MS/MS数据的峰积分、定量分析和后处理
如果需要在MultiQuant软件中创建定量方法，则选择中高级校准器进行SRM通道导入。调整峰平滑和积分参数以提供合适的峰积分，并为每种代谢物SRM分配IS化合物的适当SRM（步骤98-99）。然后将定量方法应用于分析批次，定义样品类型（即溶剂、空白、QC、标准和未知），并目视确认批次中每个样品获得的所有代谢物峰的峰积分适用性（步骤100–101）。输入或确认所有校准品和QC样品的标称浓度，以及适当的回归模型（即线性或二次）和加权因子（即无，1/x和1/x2）被选择用于每种代谢物的校准曲线。终结果表将导出以供下游分析（步骤102-103）。对于基于液体的生物样品（即微生物生长培养基），测量的浓度以与校准曲线表示的浓度单位（即μg/mL、ng/mL或nM）一致的单位报告。对于从固体材料匀浆（即粪便或脑组织）收集的提取样品，我们将测量的浓度归一化为匀浆组织的质量，表达的单位通常为ng / mg或μg / mg湿组织（步骤104）。
统计分析
尽管大部分统计分析可以使用GraphPad Prism，SigmaStat或R等软件使用多方式方差分析进行，但我们建议与计算生物学家或统计学家合作，探索宿主-微生物-代谢物关联网络，以及复杂的关联。
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