堆肥的抗菌活性有助于植物病害控制，但其原因尚不清楚。近期，来自中国科学院微生物研究所真菌与绿色农业研究组科研人员联合多家单位在《Bioresource Technology》上发表论文。该研究利用天昊微生物16S细菌和ITS真菌扩增子测序等实验，从堆肥二次发酵阶段分离鉴定了50株具有抗真菌活性菌株，并深入探讨了代表菌株对堆肥细菌及真菌群落多样性和结构的影响，以及在抑制小麦根腐病中的作用，为生产具有生防功能的生物有机肥提供了一种新的低成本策略。

英文题目：Improving suppressive activity of compost on phytopathogenic microbes by inoculation of antagonistic microorganisms for secondary fermentation

中文题目：接种拮抗微生物进行二次发酵提高堆肥对植物病原微生物的抑菌活性

期刊名称：Bioresource Technology

影响因子：11.889 (一区Top)

研究背景

长期施用无机肥料导致土壤酸化、盐碱化、肥力下降、生物活性下降，从而降低作物生产力。同时，随着畜牧业的发展，粪便处理不当可能会造成严重的环境污染。解决这个问题的一种策略是利用粪便生产有机肥料。有机肥可以通过增加土壤有机质、孔隙度、持水能力和微生物活性来提高土壤肥力。

堆肥是将固体有机废物转化为更安全、更稳定的材料（可用作土壤改良剂或有机肥料）的过程之一。完整的堆肥过程可分为两个主要阶段：生物氧化阶段和成熟阶段。在一些研究中，这两个阶段也分别称为一次发酵和二次发酵。随着技术和设备的发展，堆肥过程变得更加高效，二次发酵经常被忽略。然而，二次发酵对于提高堆肥的腐殖化程度和稳定性以及促进功能物质的形成至关重要，因此该阶段是提高堆肥产品品质的关键阶段。

除了用作有机肥料外，近还发现堆肥产品对土传马铃薯病害、灰霉病和镰刀菌枯萎病等具有抑制作用。尽管许多研究揭示了堆肥在控制植物病害方面的潜力，但由于堆肥的生物防治活性低且不稳定，因此大规模应用仍然有限。此外，堆肥的生防特性来源也不清楚。因此，需要更详细地了解堆肥的潜在生物防治机制。

提高堆肥生物控制能力的一个常见策略是将堆肥产品与生物控制微生物混合，制成称为生物有机肥的产品。然而，大多数研究使用堆肥产品作为载体来吸附生防微生物，部分生物有机肥需要额外的营养供应来维持生防微生物的生存。这种方法需要大量的生防微生物和营养元素，增加了生物有机肥料的生产成本。此外，堆肥中的微环境可能抑制生防微生物的生长和繁殖。

先前的研究表明，将特定微生物接种到堆肥中进行生物强化能够提高堆肥的效率或堆肥产品的品质。本研究旨在从二次发酵阶段的堆肥中分离具有拮抗活性的土著微生物，并评估在二次发酵阶段接种拮抗微生物对于堆肥抑制植物细菌和真菌病害活性的影响。

研究方法

本研究对牛粪堆肥中具有拮抗活性的微生物进行分离鉴定。在牛粪堆肥二次发酵阶段，每3天收集一次样品并储存在4 ºC。分别采用牛肉膏蛋白胨培养基、马丁氏培养基及高氏一号培养基分离其中的细菌、真菌和放线菌，通过对峙试验初步筛选具有抗真菌活性的菌株并进行菌种鉴定。进一步选用不同的植物病原菌与筛选菌株进行对峙试验来确定筛选菌株的抑菌谱。

为探究拮抗微生物对堆肥的影响，本研究选用筛选得到的拮抗菌株莫海威芽孢杆菌B282和铜绿假单胞菌F288进行堆肥二次发酵实验。分别设置了3种处理，包括未接种微生物的对照组（Control）、接种菌株B282的处理组（B282组）及接种菌株F288的处理组组（F288组）。在第0、10、20和30天收集样品。将收集的样品分为三部分，一部分风干进行理化分析，一部分储存在4 ºC进行微生物分析，第三部分立即在-80 ºC冻存，用于天昊微生物16S细菌和ITS真菌扩增子测序检测。

通过选择性培养基计数了二次发酵过程中接种的菌株B282和F288在堆体内的数量。

通过平板抑菌实验测定不同处理组堆肥浸提液对植物病原真菌的抗菌活性。通过盆栽试验测定不同处理组堆肥产品对小麦根腐病的防治效果。

研究结果

牛粪堆肥中具有拮抗活性的微生物

二次发酵阶段从牛粪堆肥中分离出50株对小麦根腐病菌具有抗菌活性的微生物，16S rRNA或ITS基因鉴定显示这些微生物属于6个属，包括芽孢杆菌属、假单胞菌属、链霉菌属、木霉菌属、鞘鞍醇杆菌属和纤维微菌属。这些结果表明，二次发酵阶段的堆肥中含有丰富的对植物病原菌具有拮抗活性的微生物。

其中2株细菌菌株B282和F288对所有植物病原真菌和细菌均表现出更强的拮抗活性，是堆肥中分离频率高的菌株之一。因此，选用它们进行后续堆肥实验。

接种菌株B282和F288对堆肥理化性质的影响

研究了接种或不接种菌株B282或F288的堆肥在二次发酵阶段理化性质的动态变化。如图1A所示，所有处理的堆肥温度均呈先急剧升高，后逐渐降低，后与环境温度趋于一致的变化趋势。

堆肥的含水率随时间逐渐降低（图1B）。对照组、B282组和F288组的终含水率分别为49.4%、57.9%和55.9%。接种组终含水率较高可能归因于更多的生物产水量。有机物的微生物降解可以产生水，这表明接种B282和F288可能会促进有机物的分解。

图1、二次发酵阶段堆肥温度（A）和女含水率的动态变化及接种的菌株B282（C）和F288（D）在堆体中的数量变化。

二次发酵过程中堆肥中接种微生物的增殖

根据菌株B282和F288在选择性培养基上的菌落数，研究了菌株B282和F288在二次发酵过程中不同时间点的数量。如图1C和1D所示，堆肥中B282的菌体量增加了约40倍，表明它可以在二次发酵阶段堆肥中定殖和增殖。高温可能会影响菌株B282的增殖，因为在前10天没有观察到明显的数量变化。F288菌体量在前10天迅速下降，然后略有增加，表明它可以在二次发酵阶段堆肥中存活或繁殖。

接种微生物对二次发酵阶段堆肥细菌群落多样性、结构和功能的影响

二次发酵30天后，菌群多样性如图2所示。韦恩图指数结果表明，接种B282或F288增加了二次发酵阶段堆肥细菌群落的丰度。基于不同分析方法的统计结果表明，接种B282或F288对细菌a多样性的影响较小。主坐标分析（PCoA）表明，接种组与对照组分布不同，表明接种B282或F288可以改变细菌群落b多样性。

细菌群落结构和功能的变化分析表明，3个处理组优势菌属明显不同（图2D-E）。结果表明，一些具有潜在生防活性的细菌属二次发酵后在堆肥中富集，接种组的富集属与对照组有很大差异，表明接种B282或F288重塑了细菌群落结构。

使用KEGG数据库，预测了细菌群落中合成抗菌次级代谢物的途径。如图2F所示，与对照组相比，接种组黄酮、黄酮醇、吲哚生物碱、青霉素和头孢菌素等具有抗菌活性的次生代谢产物的生物合成功能的丰度显著增加，而与铁载体、非核糖体肽和异喹啉生物碱生物合成相关的功能的丰度在组间无显著差异。以上结果表明，接种B282或F288可以增加能够生物合成某些抗菌代谢产物的细菌的丰度。

图2、接种拮抗菌株对堆肥中细菌群落多样性、结构和功能的影响。（A）显示总细菌OTU的维恩图；（B）显示了二次发酵阶段Chao1和香农指数的动态变化；（C）显示二次发酵阶段三个组的主坐标分析（PCoA）；（D）显示二次发酵阶段堆肥细菌在属水平上的组成和演替；（E）显示富集于接种组的具有抗菌或植物生长促进活性的属；（F）显示了三个组预测的抗菌相关功能丰度的差异。

接种微生物对二次发酵阶段堆肥真菌群落多样性和结构的影响

对真菌群落丰富度和多样性的分析发现，对照组、B282组和F288组分别有793、2747和1422个真菌ASV（图3A）。Chao1和香农指数的分析结果无统计学差异。这些结果表明，B282和F288对真菌群落的丰富度和多样性具有不同的影响。PCoA分析表明，所有组的真菌群落结构随时间变化很大，接种B282或F288可以改变堆肥中的真菌群落。

对真菌群落结构分析发现，与细菌群落相比，真菌群落的组成和演替不太复杂但仍存在一些差异，特别是在二次发酵后期。以上结果表明，接种B282或F288可以重塑堆肥的真菌群落结构。

图3、接种拮抗菌株对堆肥中真菌群落多样性和结构的影响。（A）显示总真菌ASV的维恩图；（B）显示了二次发酵阶段Chao1和香农指数的动态变化；（C）显示二次发酵阶段三个组的主坐标分析（PCoA）；（D）显示了二次发酵阶段堆肥真菌在属水平上的组成。

堆肥浸提液的抗真菌活性

二次发酵后获取各实验组堆肥浸提液，测试其对5种植物病原真菌的抑制活性（图4）。研究表明，堆肥浸提液可以抑制植物病原菌的生长并减少植物病害。本研究进一步表明，接种拮抗微生物进行二次发酵可提高堆肥浸提液的抗真菌活性。

图4、3个实验组堆肥浸提液对不同植物病原菌的抑制率。

堆肥防治小麦根腐病的盆栽试验

本研究后分别用不同堆肥和商业生防菌剂，通过盆栽试验来测定它们对小麦根腐病的防病效果（图5）。在含有小麦根腐病菌的土壤中生长的小麦幼苗（处理I）明显比在未接种病原菌的土壤中生长的小麦幼苗（处理H）要矮小，尽管出苗率受该病原菌的影响不显著。添加不同堆肥均减少了小麦根腐病菌对小麦生长的负面影响。与添加对照组堆肥的实验组（处理I+Control）的幼苗相比，添加B282和F288组堆肥的实验组（处理I+B282和I+F288）的幼苗明显更高更密集。I+B282、I+F288和添加商业生防枯草芽孢杆菌菌剂的实验组（处理I+BCA）间幼苗高度无显著差异，说明接种了B282或F288的堆肥的生防效果与市售生防枯草芽孢杆菌菌剂相当。

图5、人工接种拮抗微生物对堆肥防治小麦根腐病效果的影响。（A）小麦幼苗表型图。（B）和（C）分别显示了不同处理下小麦的出苗率和平均株高。

研究结论

在堆肥二次发酵阶段，从堆肥中分离出50株具有抗真菌活性的微生物菌株。接种其中的莫海威芽孢杆菌B282和铜绿假单胞菌F288后，重塑了堆肥微生物群落，提高了堆肥的抗真菌活性，增强了堆肥对小麦根腐病的防病效果。结果表明，人工接种堆肥来源的拮抗微生物可以提高堆肥在植物病害防治方面的活性，能够成为一种生物肥料生产的低成本策略。

中国科学院微生物研究所研究博士生赵彬涵为论文第一作者，孙宪昀为该论文的通讯作者。参与此项工作的还有李少杰、曹先贺、蔡占军、张龙、张皓月等人。该研究得到中国科学院战略性先导科技专项、国家重点研发计划项目、鄂尔多斯科技成果转化项目和中央引导地方科技发展资金项目的资助。

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