前言：

2020年食管癌在所有癌症发生率和死亡率中分别排在第七和第六位。食管鳞癌（ESCC）是食管癌的主要组织亚型之一，其较低的生存率与症状出现较晚，对治疗有耐药性，且具有复杂的异质性有关。

瘤间和瘤内异质性是所有癌症的重要特征，然而传统的RNA测序技术无法在转录组水平揭示异质性。近年来，单细胞转录组测序（scRNA-seq）为研究细胞组成及肿瘤异质性提供了重要的武器，已经在很多癌种中受到广泛应用。尽管已经有一些关于ESCC的scRNA-seq工作研究异质性及肿瘤微环境的转录特征，但是一些特定的细胞类型复杂性及细胞间通讯信息需要进一步揭示。

为了进一步找到ESCC中一些细胞类型特异性的标记物，近日河南医学高等专科学校石科副教授和郑州大学李悦淇副教授合作在FASEB Journal杂志（IF:5.834）发表新研究论文，利用单细胞RNA测序技术揭示了ESCC中不同细胞类型的转录异质性，并且在上皮和成纤维细胞中发现了一些细胞类型特异性预后标志物。这项研究为ESCC提供了全面的单细胞转录组分析，并剖析了ESCC肿瘤微环境中与肿瘤进展相关的主要细胞类型的分子特征。值得一提的是，天昊生物有幸参与了其中的单细胞转录组测序及数据分析工作。

主要研究结果

01 主要细胞类型分析

作者利用10x Genomics平台对3例ESCC患者肿瘤和癌旁组织进行scRNA-seq，质控后获得高质量的33,993个单细胞，包括10种主要的细胞类型，文章对这些细胞类型进行了详细的注释，单细胞结果也显示出ESCC不同样本中肿瘤微环境的异质性（图1）。

图1 scRNA-seq揭示ESCC细胞多样性

02 上皮细胞亚群分析

对上皮细胞进行细胞亚群分析发现了13个亚群，亚群主要以样本区分开能够反映瘤间异质性。对来源于肿瘤和正常组织的上皮细胞进行差异分析发现490个基因存在显著差异，其中一些基因包括IFI6和TGFBI的高表达显示出ESCC患者较差预后。GSVA分析显示多数hallmark基因集富集在肿瘤上皮细胞中。拷贝数分析并未显示肿瘤样本有显著的CNV改变（图2）。

图2 ESCC上皮细胞转录异质性

03 成纤维细胞亚群分析

对成纤维细胞进行亚群分析发现由炎症性肿瘤相关成纤维细胞（iCAF，高表达CFD和CXCL12）和肌成纤维样肿瘤相关成纤维细胞（myCAF，高表达ACTA2和TAGLN）组成，两种亚群细胞存在不同的样本分布。iCAF和myCAF差异分析分别鉴定出不同的marker基因，其中myCAF特异性高表达的MRVI1和MYLK与ESCC不良预后相关（图3）。

图3 成纤维细胞亚群分析

04 T细胞亚群分析

对T细胞进行亚群分析共鉴定出8个亚群，包括6个CD4+和2个CD8+细胞群。肿瘤组织有相对更高比例的CD4 HAVCR2、Tregs和CD8-1细胞，其中CD8-1高表达一些细胞因子和效应分子，CD4 HAVCR2高表达一些耗竭性marker，而Tregs上调共刺激分子（图4）。

图4 T细胞亚群分析

05 CD4+细胞拟时分析

进一步对CD4+细胞进行拟时轨迹分析发现主要由两种轨迹组成，Tregs在起点。对这些CD4+细胞分析与过渡状态相关的表达变化，发现可以分成4个阶段，不同阶段分别可以富集不同的基因及相关通路，如起始阶段可能与IFN-γ和IFN-α反应相关（图5）。

图5 CD4+细胞拟时轨迹分析

06 髓细胞亚群分析

对髓细胞进行亚群分析发现由3群树突细胞、3群巨噬细胞和2群单核细胞组成，几乎所有的巨噬细胞来源于肿瘤样本，表明肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）可能促进ESCC肿瘤形成和进展。树突细胞在正常样本中占比更高，而两群单核细胞具有不同的分布。文章也对不同髓细胞亚群marker及通路进行了详细分析（图6）。

图6 髓细胞亚群分析

07 细胞通讯分析

对主要细胞类型进行细胞通讯分析发现上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和髓细胞显示出与其它细胞更广泛的细胞通讯。重点对上皮细胞和T/髓细胞亚群进行分析发现髓细胞亚群存在更多的细胞交流，上皮细胞中免疫应答基因（包括APP、COPA、MIF）表达较高，而受体基因CD74在髓系细胞中表达较高（图7）。

图7 细胞通讯分析