肿瘤微环境（TME）已被证明在各种适应症中强烈影响癌症患者的治疗结果，并影响总生存期。然而，在胃癌中形成TME的细胞还未被广泛地描述。2022年12月22日，Genome Biology杂志（IF：17.906）在线发表了BIOPIC张泽民、北京大学肿瘤医院步召德、北京大学人民医院申占龙及拜耳公司Helge G. Roider合作的论文“Parallel single‑cell and bulk transcriptome analyses reveal key features of the gastric tumor microenvironment”，利用并行的单细胞和常规转录组分析揭示了胃肿瘤微环境的关键特征，为胃癌患者分层的新潜在生物标志物的识别提供了独特的资源，有助于进一步阐明胃癌的发生机制，并为治疗提供思路。

01 主要研究结果

1.胃癌整体细胞微环境图谱

为了表征胃癌TME，研究人员对24例未经治疗的胃癌患者肿瘤及配对的非恶性胃组织进行了bulk组织RNA测序（RNA-seq）、全外显子测序以及单细胞RNA-seq（图1A）。为了识别组成胃TME的细胞类型，样本被快速消化成单细胞，通过荧光激活细胞分选（FACS）去除EPCAM阳性的上皮细胞，富集非上皮起源的所有细胞用于单细胞分析。结果获得的96623个细胞可以分成11个主要细胞类型及81个亚型（图1B），主要细胞类型可以根据定义的标记基因进行注释（图1C）。为了在后续表征TME和正常胃基质之间的差异，作者量化了每种基质细胞类型中与恶性转化相关的细胞丰度和细胞活性的变化。

图1 良性和恶性胃样本中EPCAM阴性细胞的细胞图谱

2.肿瘤基质细胞整合分析发现激活的成纤维细胞存在

对16492个成纤维细胞及壁细胞进行重聚类分析发现15个细胞簇（图2A）。通过分析特定的marker基因表达（图2B），这些细胞主要被分成静息态成纤维、激活成纤维细胞及壁细胞（周细胞和平滑肌细胞组成）。恶性和非恶性样本的簇分数比较显示亚群F13-CTHRC1为高度癌症相关的成纤维细胞（CAFs），同时揭示了胃TME中几个静息成纤维细胞簇的急剧减少（图2B）。

为了更好地描述与恶性转化相关的转录变化，作者整合了bulk和scRNA-seq数据并确定了在单细胞群中具有不同表达模式的上调（U）和下调（D）基因簇（详见原文方法）。在上调的簇中，U1在静息和激活的成纤维细胞中表达，富集的基因与细胞外基质重塑相关。此外，U6和U7分别在L12-ANGPT2周细胞和F13-CTHRC1 CAFs中高表达（图2C）。簇U7包含与成纤维细胞增殖（WNT5A和WNT2）、基质重塑（MMP1和MMP3）和细胞迁移（PDPN和TWIST1）相关的基因（图2D）。来自簇U7的所有基因都在F13-CTHRC1激活的成纤维细胞中特异性表达，并且在TCGA独立的胃癌队列中与低生存率相关（图2E）。

图2 癌症相关成纤维细胞的转录组重编程

3.肿瘤内皮细胞将免疫吸引转化为血管生成途径

通过分析数据中的3684个内皮细胞发现了9个簇，对应于6种不同的内皮细胞亚型（图3A），根据不同的marker表达可以定义为特定的类型（图3B）。同样地，簇分数比较显示EN10-SERPINE1和EN03-ESM1簇（称为激活的内皮细胞）几乎完全是肿瘤特异性细胞类型（图3B）。

为了确定肿瘤内皮细胞的功能，首先对激活的内皮细胞和剩余的内皮细胞进行差异基因表达分析。随后对显著差异表达基因进行基因集富集分析显示，EN10-SERPINE1和EN03-ESM1中的血管生成和细胞运动反应途径增加，抗原呈递和免疫防御基因减少，表明胃癌中通过内皮细胞的免疫细胞吸引减少（图3C）。

鉴于血管生成对肿瘤持续生长至关重要，作者推测这些细胞类型可能与生存率差有关，并发现在TCGA独立胃癌队列中，SERPINE1表达与生存率急剧恶化有关（图3D）。同时使用EN10-SERPINE1簇的20个特异性基因的特征发现了生存率的可较性差异（图3E）。

图3 胃癌中混合的内皮细胞状态

4.巨噬细胞呈现炎症两种状态

对10546个髓细胞重聚类发现15个亚簇，可以分为巨噬细胞、树突细胞和中性粒细胞（图4A）。根据不同的marker表达，巨噬细胞可以进一步分成促炎、抗炎和组织驻留的巨噬细胞（图4B）。髓细胞在TME中显著增加，只有组织驻留的巨噬细胞在健康的胃组织中增加。特别是胃的TME以M07-APOE, M11-SPP1和M04-C3抗炎巨噬细胞显著增加为特征（图4C）。

令人惊讶的是，作者发现在scRNA-seq数据和TCGA的独立胃腺癌队列中，上述促炎和抗炎基因特征的表达在患者样本中呈负相关（图4D），而且在TCGA胃癌队列中抗炎特征的表达与降低的生存率显著相关（图4E）。

图4 促炎和抗炎巨噬细胞呈负相关

5.淋巴细胞向免疫抑制和分化表型转移

肿瘤和正常样本中CD8+ T细胞的比例几乎保持不变，相反的是胃肿瘤样本中CD4+ T细胞增加了5倍以上。对12905个CD4+ T细胞重聚类分成了8个亚簇，并能鉴定出6种T辅助细胞亚型（图5A）。而CD8+ T细胞和NK细胞可以分成13个亚簇，其中12个对应到8种CD8+ T亚型（图5B）。这些细胞亚群中，免疫抑制的Th17和Treg细胞是肿瘤中增加多的CD4+ T细胞，而初始CD8+ T细胞减少（图5C），可能反映了T细胞在肿瘤中的激活和扩增。Bulk和单细胞数据整合分析发现一个基因簇U4在胃癌中上调，其偏好性地表达在T01-ICOS中（图5D、E）。

图5 胃癌中免疫抑制性T细胞动态

6.细胞通讯网络揭示胃癌进展的潜在驱动因子

通过分析配体和受体表达信息建立起胃癌细胞通讯网络，发现F13-CTHRC1在TME网络中表现出高的中心性指数，与许多细胞亚型有显著的联系（图6A），包括其它的成纤维细胞、脉管相关内皮细胞和免疫细胞（图6B-E）。这些发现表明F13-CTHRC1通过与内皮细胞和免疫细胞的血管生成刺激和免疫抑制相互作用，在胃癌进展中发挥潜在作用。

图6 从胃癌单细胞数据推断的细胞通讯显示F13-CTHRC1成纤维细胞的核心作用

7.细胞类型特征可预测独立胃癌队列中患者的预后

作者随后利用单细胞数据作为参考，使用CibersortX推断TCGA样本中每种细胞亚型的比例，随后评估每种细胞亚型高分数和低分数患者之间的生存差异。值得注意的是，肿瘤相关细胞亚型F13-CTHRC1和EN10-SERPINE1比例较高的患者生存时间显著缩短（图7A、B）。相比之下，cDC1树突状细胞的比例（M16-cDC-CLEC9A）对患者的生存有显著的积极影响（图7C）。细胞通讯发现M16-CLEC9A通过一系列通讯信号（突出的包括XCL1/ XCL2-XCR1受体-配体轴）与广泛的CD8+ T细胞和NK细胞群相互作用（图7D）。因此，结合这些负相关的特征，在F13富集/M16缺失患者和F13缺失/ M16富集患者之间存在更明显的生存差异（图7E）。

图7 独立胃癌队列的bulk RNA-seq去卷积分析揭示细胞亚型对预后的影响

8.整合胃癌免疫治疗bulk RNA-seq数据揭示细胞和分子治疗响应倾向

为了确定哪些细胞类型和TME信号通路可能导致对免疫检查点抑制剂（ICI）治疗的耐药性，作者从近的一项胃癌研究中获得了bulk RNA-seq数据，该研究评估了45例接受抗PD-1（pembrolizumab）治疗的患者的肿瘤样本中的基因表达。差异基因表达分析结果显示，在12例响应患者和33例无响应患者的治疗前样本中，分别有696个和1382个基因显著高表达（图8A）。

在当前的单细胞表达数据中，对696个与治疗响应相关的基因进集行双聚类，得到8个基因组别，指定为R1至R8（图8B）。簇R1仅在T细胞和NK细胞中表达，并强烈富集与IFN-γ信号通路相关的基因。有趣的是，簇R8含有显著的标记基因，如C1QA和C1QB，在M11-SPP1抗炎巨噬细胞中表达高，表明这些细胞对免疫治疗反应具有积极影响（图8C）。同样地，对非响应相关的基因也进行了类似的分析（图8B），发现了四种不同的基因簇，NR10、NR11、NR12和NR13，分别在周细胞、静息成纤维细胞、F13-CTHRC1和激活成纤维细胞中具有高度特异性（图8D）。

为了研究在胃TME中确定的11种主要细胞类型或81种亚型中是否有任何一种可以用于预测免疫治疗的反应，作者分析了由每种细胞类型的主要标记基因组成的二元分类模型在上述胃癌免疫治疗队列中预测治疗结果的能力。结果显示在该队列中，T27循环CD8+ T细胞的存在（ROC曲线下面积为0.85）及随后的泛CD8+ T细胞（0.81）的预测治疗结果佳（图8E）。而F14-ADAM28激活成纤维细胞的存在以及泛成纤维细胞的存在是对无响应的佳预测，AUROC分别为0.82和0.7（图8E），特异性高达100%。

图8 肿瘤免疫治疗应答和非应答基因的细胞起源

02 结果总结

本研究对24例未经治疗的胃癌患者肿瘤及配对正常组织进行bulk和单细胞转录组测序，以更好地了解哪些细胞类型和转录程序与胃的恶性转化相关。96623个非上皮来源的细胞聚类揭示了81种明确定义的TME细胞类型。结果发现激活的成纤维细胞和内皮细胞在肿瘤中显著更多。细胞间网络重建和一个独立队列的生存分析表明，这些细胞类型以及免疫抑制髓细胞亚群和调节性T细胞在建立与抗PD1治疗患者预后恶化和缺乏响应相关的免疫抑制微环境方面的重要性。相比之下，研究发现IFNγ激活的T细胞亚群和表达HLA-II的巨噬细胞与治疗响应和总生存率的增加有关。