在细胞生物学中，基因过表达和敲除/敲降技术通常成对用于研究选定的基因。在肠道菌群研究中，细菌植入和悉生动物模型常用于对感兴趣细菌的研究。然而，在肠道菌群研究中，仍然没有敲除/敲降细菌的标准方案。

近期，来自西安交通大学第一附属医院刘冰、朱峰、马现仓、王亚文教授团队科研人员联合多家单位在Cell子刊《Cell Reports Methods》上发表论文。该研究创新性提出了噬菌体定向敲除肠道细菌动物模型（Targeted-Bacterium-Depleted mouse model, TBD），并利用天昊微生物创新型Accu16S^®绝对定量测序及行为学系列实验，充分验证了TBD模型这一类似于细胞生物学中基因敲除技术CRISPR的强大工具，可以靶向敲除目标肠道菌群，而接受噬菌体处理的动物表现出除目标细菌敲除外几乎完整的肠道细菌谱。这一发现为研究肠脑轴动物模型的建立提供了一个全新的方法，并有望成为研究肠道菌群相关疾病的有力工具。

Cell Reports Methods简介  

Cell Reports Methods是Cell Press在2021年推出了一本开放获取多学科期刊，是CNS子刊中除Nature Methods外唯一方法学专刊，更侧重与可重复的稳健方法。关注的领域包括测序和成像技术、基因组编辑、单分子方法、计算方法、生物技术和合成生物学等方面的创新方法。

英文题目：Bacteriophages allow selective depletion of gut bacteria to produce a targeted-bacterium-depleted mouse model

中文题目：噬菌体可以通过对肠道细菌的选择性敲除产生靶向敲除细菌小鼠模型

期刊名称：Cell Reports Methods

摘 要

肠道微生物组对人类健康至关重要。小鼠微生物群模型，包括悉生小鼠，是阐明肠道细菌功能的有用工具。在这里，文章提出了一种靶向细菌敲除（TBD）模型，使用裂解噬菌体选择性地敲除健康或其他模型小鼠的肠道细菌。这些噬菌体处理的动物除了敲除的细菌，应该具有几乎完整的肠道细菌谱。为了证明这一概念，研究者采用大肠杆菌特异性噬菌体T7来抑制健康小鼠中的大肠杆菌。实验结果表明，敲除大肠杆菌的小鼠表现出类似勇敢的行为，并且与大肠杆菌的存在相关，而不是肠道细菌之间的平衡。因此，研究者证明TBD模型是一种阐明近乎完整肠道菌群环境中特定细菌物种功能的有力工具。

研究方法

肠道是人体中大的微生物群库，存在着一系列细菌、真核生物和病毒。肠道细菌的多样性和相互作用极大地影响宿主的新陈代谢，与人类健康的诸多方面息息相关。例如，肠道菌群可以调控宿主免疫反应，微生物群组成的改变能够影响一系列疾病的发生发展此外。药物作用通常会对肠道菌群产生影响，会对如用于治疗精神分裂症等心理健康状况的疗法产生了深远影响。

微生物群-肠-脑轴（MGB）是微生物群-宿主相互作用的典型例子。MGB从肠脑轴（GBA）扩展而来，它描述了大脑和肠道神经系统之间的双向通信，描述了肠道菌群与中枢神经系统之间的关系。例如，肠道微生物可以产生神经活性分子，通过迷走神经在肠道神经系统和大脑之间发出信号。在胁迫条件下，微生物群的组成也可以通过下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）通过肠上皮细胞进行调节。一些肠道细菌的丰度与心理健康状况相关，称为心理生物组（psychobiome）。例如，肠道中的Streptococcus vestibularis可以诱导精神分裂症样行为，抑郁症患者的Coprococcus和Dialister水平通常降低。

大肠杆菌占肠道菌群的0.1%-5%，是一种特征明确的模式生物，可用于研究MGB。虽然它产生对哺乳动物宿主功能至关重要的维生素K和B12，但它也可能诱发患者的精神症状。此外，具有诱导焦虑样行为的小鼠肠道大肠杆菌水平升高。研究者目前对MGB的大部分理解都是使用具有抗菌处理的人造动物模型确定的，包括无菌小鼠和无特异性病原体（SPF）小鼠。这些动物模型有其自身的优势：抗生素处理的小鼠模型易于研究，但无法评估单个细菌菌株的影响。虽然使用接种了选定微生物无菌小鼠的悉生小鼠模型是研究特定菌株的金标准，但其生理影响在自然环境中可能不具有代表性。此外，使用悉生生物模型的研究既耗时又昂贵。

在这里，研究者提出了一种新的动物模型，该模型结合了悉生小鼠模型在细菌菌株精度方面的优点，以及仅使用普通小鼠即可建立的便利性。通过使用裂解噬菌体，可以在动物模型中靶向敲除特定的肠道细菌。为了证明这一假设的可行性，研究者选择使用大肠杆菌特异性噬菌体T7从健康小鼠的肠道中去除大肠杆菌，并通过分子和表型分析来检测其影响(图1)。令人惊讶的是，这些靶向敲除大肠杆菌（TBD）小鼠表现出类似于先前发表的抗焦虑和抗抑郁治疗效果的行为变化。与对照组相比，这些原本健康的动物获得了“勇敢”的个性，没有过度活跃。因此，本研究表明TBD小鼠模型提供了一种与传统悉生模型互补的方法来验证实验数据，并且可以通过选择不同噬菌体来研究各种肠道细菌。

图1、靶向细菌敲除（TBD）模型与悉生小鼠模型的比较。TBD模型使用裂解噬菌体来抑制靶向细菌的水平，为悉生小鼠模型提供了一种补充方法。

研究背景

本研究使用健康的6周龄雌性C57BL/6J小鼠，用大肠杆菌噬菌体T7与大肠杆菌（菌株K12）进行处理。在噬菌体处理后第0、1、2、4、6、8、10、12和14天收集粪便样品。本研究行为测试包括：旷场实验、互惠社交互动测试、三箱社交测试、高架十字迷宫试验、新物体识别测试、新颖性抑制饲养试验和悬尾实验。行为实验后，每组随机3只小鼠，对肠道等器官进行组织学分析。

本研究使用天昊生物Accu16S^®绝对定量测序技术，对小鼠肠道细菌的绝对丰度和多样性进行分析。此外也使用了qPCR实验对小鼠粪便中的细菌和大肠杆菌，以及T7噬菌体总量进行检测。

研究结果

T7噬菌体给药对小鼠身体状况无明显影响

为了验证研究者的模型，使用靶向大多数大肠杆菌菌株的T7噬菌体。本实验通过小鼠胃内给药处理方式，分别设置了106 PFU/mL T7（T7L）、1011 PFU/mL T7（T7H）、1011 PFU/mL 失活T7（高压灭菌处理）（dT7H）和水处理共4个平行组，并测量各种生命体征，收集粪便样本，并定期进行一系列行为测试（图2A）。正如预期的那样，T7噬菌体处理后对小鼠的身体状况没有明显影响（图2B）。

T7噬菌体选择性敲除大肠杆菌但不影响整体肠道细菌群

研究者使用qPCR来量化大肠杆菌和总肠道细菌的数量，以跟踪噬菌体给药后的动态变化。在14天的过程中，所有组中的肠道细菌总体种群没有显示出明显的扰动。相比之下，T7H组与对照组相比，大肠杆菌迅速降低至∼10%，并在第14天逐渐恢复至∼25%，可能是由于其对噬菌体的获得性抗性。此外，T7L组大肠杆菌的下降在第6天后开始，并在第8天时达到与T7H相同比例（图2C）。

图2、T7噬菌体抑制大肠杆菌水平但不影响身体状况和肠道细菌的整体种群。（A）本研究中使用的时间框架和行为测试的示意图（每组n = 12）。OFT，旷场实验；RSIT，互惠社交互动测试；TCST，三箱社交测试；EPM，高架十字迷宫试验；NOR，新物体识别测试；NSF，新颖性抑制饲养试验；TST，悬尾实验。（B）身体状况：在不同时间测量的体重（左），每日饮水量（中）和每日食物摄入量（右）（每组n = 12）。（C）通过qPCR随时间定量的大肠杆菌水平（左）和总细菌水平（右）随时间变化（每组n = 12）。

大肠杆菌敲除导致肠道菌群中物种代表性的减少

为了研究大肠杆菌减少的级联效应，研究者使用天昊生物Accu16S®绝对定量测序技术，通过对16S rRNA基因扩增子（V3-V4区）进行测序来获得微生物分类单元的绝对丰度，以评估肠道菌群的动态变化。实验在4个时间点（即0天和T7噬菌体处理后4、8和14天）研究了粪便微生物群组成。结果发现Chao1指数存在显著性差异，但香农和辛普森多样性指数没有显著影响。相对于对照小鼠，大肠杆菌敲除小鼠的肠道中细菌丰富度降低（图3）。时间和T7噬菌体对微生物组成的β多样性均有显著影响（图3D）。随着T7噬菌体处理，敲除大肠杆菌小鼠肠道菌群β多样性逐渐降低，其β多样性在第8天升高，但在第14天下降。在噬菌体灌胃后第4天和第14天，大肠杆菌敲除小鼠中25和31个肠道细菌属的绝对丰度与对照小鼠存在差异。此外，24个肠道细菌属的丰度表现出明显的纵向变化，而两组之间微生物群的纵向改变模式不同（图3E）。

图3、利用天昊16S扩增子绝对定量测序技术，检测对照组和T7H组第0、4、8和14天大肠杆菌敲除引起肠道菌群的动态变化。（A-C）肠道菌群α多样性指数（香农、辛普森和Chao1）。（D）基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）。（E）受T7噬菌体调控并随时间显著变化的24个细菌属的丰度变化热图：左为对照组，右为T7组。

大肠杆菌敲除的小鼠表现出行为异常

为了探讨肠道大肠杆菌对宿主的影响，研究者进行了7项行为测试，涵盖精神状态和社交能力，其中五项测试显示T7H组与对照组比较。在旷场实验（OFT）中，虽然每组的总距离没有差异，这表明各组之间的基础运动活动相似，但T7H小组在明亮的开放区域花费了更多时间，并表现出类似于抗焦虑药给药的行为模式（图4A）。在高架十字迷宫（EPM）实验中，小鼠在T7H组更频繁地进入高悬敞开臂，并持续更长时间，这显示出与先前报道的抗焦虑小鼠相似的模式（图4B）。在新颖性抑制饲养（NSF）实验中，由于NSF对急性抗焦虑药和慢性抗抑郁药治疗敏感，但对急性抗抑郁药不敏感，因此两个T7处理的动物组都表现出类似于先前描述的抗焦虑药给药的行为（图4C）。在悬尾实验（TST）中，来自两个T7处理小鼠的不动时间T7H和T7L明显短于对照组（图4D）。由于TST通常用于评估抗抑郁活性，噬菌体T7作为一种有效的抗抑郁药，但不是抗焦虑药。相比之下，这些群体的一般社交能力和对社会新奇的兴趣之间没有差异。这些指标通过三箱社交测试（TCST）进行评估，自闭症相关的行为缺陷通过互惠社交互动测试（RSIT）评估，小鼠的学习和记忆通过新物体识别（NOR）测试进行评估，这表明小鼠的一般社交能力和记忆不受噬菌体的影响（图4E）。值得注意的是，大肠杆菌种群T7L组下降到T7H组在第8天的水平，正是在这个时间点，T7L组开始表现出与T7H相似的行为异常。因此，两个实验组的结果表明，小鼠的行为障碍与大肠杆菌种群直接相关，而不是对整个肠道菌群的级联效应。

噬菌体处理小鼠的主要器官未发现病理异常

在解剖学上，各组小鼠小肠和大肠上皮表现出反应性增生，保留了正常的腺体结构和核极性（图4F），细胞显示出核质比轻度增加，细胞核略微增大，核深染和有丝分裂率增加，而不存在明显的多形性和非典型有丝分裂。此外，其他主要器官没有观察到异常，即脑、心、肺、肝、脾和肾的病理形态在所有组间没有差异，这表明宿主的生理健康不太可能与行为改变有关。

图4、大肠杆菌敲除小鼠表现出抗焦虑药处理的行为模式。（A）旷场实验。（B）高架十字迷宫试验。（C）新颖性抑制饲养测试。（D）悬尾实验。（E）三箱社交测试。（F）各组小肠和大肠上皮细胞病理形态表现为反应性增生，各组间保持正常腺体结构和核极性。

行为恢复与大肠杆菌种群的恢复相关

大肠杆菌在第14天逐渐恢复到T7前水平的25%，进一步确定噬菌体干预后细菌是否可以完全恢复正常非常重要（图2C）。研究者使用qPCR实验对T7H组和对照组进行粪便大肠杆菌水平追踪实验。第16天的大肠杆菌水平约为对照组的30%，与上一次实验中第14天观察到的水平相似（图5A）。随着细菌水平继续恢复，在大约第24天恢复到噬菌体处理前的水平。为了确认行为异常是由于大肠杆菌敲除引起的，研究者还通过将大肠杆菌灌胃到T7处理的小鼠进行了挽救实验（图5B）。研究者在第0天（基线）、第4天（T7H管饲后）和第8天（大肠杆菌管饲后）使用TST评估小鼠行为。qPCR结果显示，在14天的实验中，由于口服强饲噬菌体和大肠杆菌，大肠杆菌水平出现波动（图5B）。TST结果在T7H处理和大肠杆菌挽救实验后，反映符合粪便大肠杆菌的水平（图5C）。值得注意的是，第8天的结果表明，小鼠在重新引入大肠杆菌后恢复正常。

图5、大肠杆菌自我恢复与挽救实验。（A）T7处理组肠道大肠杆菌水平在14天实验后逐渐恢复（数据从第16天开始），并在第24天恢复到噬菌体处理前水平。（B）T7处理组与对照组在14天挽救实验期间的肠道大肠杆菌比例水平，在第4天施用噬菌体，在第8天给予大肠杆菌管饲（n = 12）。（C）第0，4和8天的TST结果显示小鼠的行为变化与大肠杆菌的敲除和重新引入之间的相关性。

实验结论

无菌和悉生小鼠模型已被广泛用于肠道菌群研究，用于证明某些细菌与人类疾病之间的直接联系。虽然这种方法为确定接种微生物在受控环境中的具体贡献提供了优势，但它没有考虑群落中的一般微生物种群，特别是由于一种细菌变化而导致的物种代表的变化。以前使用悉生动物对大肠杆菌的研究表明，肠道防御能力的加强以及对精神的作用。此外，口服大肠杆菌已被证明可以增加健康小鼠的焦虑样行为，并且大肠杆菌衍生的脂多糖（LPS）被证明在抗抑郁药样但不是抗焦虑样行为中发挥重要作用。研究者的大肠杆菌敲除TBD模型证明了大肠杆菌在具有完整肠道菌群的野生型小鼠的神经学作用。这些小鼠表现出独特的“勇敢”行为特征，与先前发表的由联合抗焦虑药和/或抗抑郁药治疗引起的行为模式有一定程度的相似性。

通过检测大肠杆菌的数量和细菌多样性随时间的变化，研究者得出结论，大肠杆菌丰度是导致观察到的行为变化的原因，研究者推测除了LPS之外，其他大肠杆菌衍生物可能是原因。能够随着时间的推移快速评估目标细菌和微生物群环境，是与仅单独检测选定细菌的悉生模型相比的明显优势。同时，大肠杆菌噬菌体作为单剂量提供抗抑郁或抗焦虑作用以治疗抑郁症或焦虑症的潜在应用应在未来的研究中进一步研究。这种具有成本效益和时间效率的TBD模型将加速肠道细菌与健康之间新相互作用的建立。

该研究获得国家科技部重点专项、国家自然科学基金、陕西省重点研发计划的资助，并获得了西安交通大学第一附属医院生物样本信息资源中心和脑科学研究中心的大力支持。西安交通大学博士生李琰清，西安交通大学第一附属医院朱峰教授、李燕教授文章共同第一作者，刘冰教授、马现仓教授、王亚文教授为文章共同通讯作者。

关于天昊微生物绝对定量测序

特色创新技术：

为了解决传统微生物扩增子测序“只能相对定量”的技术痛点，天昊生物投入大量研发人员，率先于2018年推出了创新型微生物绝对定量测序服务。多年来，天昊生物一直聚焦微生物绝对定量技术创新与发展，不断扩展检测范围，提高检测标准，帮助了客户研究论文的高效发表。绝对定量技术取得了“应用领域范围广，文章发表水平高”的骄人成绩，己经成为国内微生物扩增子绝对定量测序领域的行业领跑者。

天昊生物绝对定量技术发展

           大事件：

★2018年 国内率先推出细菌扩增子绝对定量测序服务，命名为“Accu16S^®细菌绝对定量测序”。

★2021年 国内率先推出真菌扩增子绝对定量测序服务，命名为“AccuITSTM真菌绝对定量测序”。

→ 2019年 天昊绝对定量测序技术提交专利申请。

→ 2019年 亮相“中国微生物学会学术年会”及“中国肠道大会”，天昊绝对定量技术引关注。

→ 2019年6月 天昊绝对定量在农学环境领域第一篇文章成功发表在《Science of the Total Environment》（IF=10.753）上。

→ 2019年9月 天昊绝对定量在医学领域第一篇文章成功发表在《Carbohydrate Polymers》（IF=10.723）上。

→ 2020年 推出绝对定量测序“GS-Online”分析云平台服务。

→ 2021年 天昊生物绝对定量技术“昊论坛”成功举办，邀请三位高分文章第一作者讲座，分享使用天昊绝对定量技术的经验心得。

→ 2022年4月 天昊绝对定量技术在“肠-骨轴”研究领域成功发表在期刊《Science Advances》（IF= 14.957）上。

→ 2022年6月 同时利用天昊细菌+真菌绝对定量技术的第一篇文章成功发表在食品一区期刊《Food Research International》（IF= 7.425）上。

→ 2022年 参展“中国生物物理学会肠道菌群分会年会”和“中国微生物学会第十届地质微生物学学术研讨会”，并作绝对定量技术大会报告。

→ 2022年 绝对定量检测项目和合作单位数量取得新突破，合作的单位包括清华大学、北京大学、上海交通大学、复旦大学、中南大学湘雅医院、北京工业大学、潍坊医学院、南京农业大学、厦门大学、中国科学院海洋研究所、中国科学院南京土壤研究所、中国农业大学、南京农业大学、南京财经大学、南京中医药大学、华中科技大学、宁夏大学、东北农业大学、新疆医科大学公共卫生学院、山东大学齐鲁医院、武汉大学中南医院、海南农科院等多个科研单位，覆盖环境微生物和肠道微生物等领域。

天昊生物绝对定量测序“GS-Online”分析云平台

天昊绝对定量技术助力客户的“肠-骨轴”研究登陆《Science Advances》

天昊生物绝对定量技术

     发表文章情况：

截至目前，天昊客户利用微生物绝对定量技术共发表SCI文章35篇，其中JCR分区在Q1区的高分文章多达20篇，研究领域涉及医学、环境、农学和生态等各个领域，样本类型包括人类及动物粪便、土壤、体外发酵液、水体生物膜、酒类发酵物及口拭子DNA样本等。

 具体涉及研究方向包括： 

● 医学领域：

1：“肠-骨轴”调控股骨头坏死机制重大发现

2：帕金森病与肠道菌群新成果

3：阴道炎治疗与肠道菌群研究

4：头颈癌与肠道菌群研究

5：骨质疏松症与肠道菌群研究

6：肝细胞癌与肠道菌群研究

7：肠道菌群体外发酵研究

8：金针菇多糖抗炎与肠道菌群研究

9：益生元与人体肠道菌群研究

● 环境农学领域：

1：塑料污染物降解核心微生物研究

2：脱氧海水与微生物碳氮循环研究

3：微生物与人工湿地污染物清除研究

4：微生物与废水处理功能基因关联研究

5：活性污泥与微生物群落研究

6：水体沉积物与微生物群落研究

7：不同施肥方式对土壤微生物的影响

8：施用氮肥对土壤粘细菌的影响

9：蓄水池生物膜与微生物净水研究

10：食品发酵物与微生物研究

11：农业种植方式与土壤微生物研究

12：农业复垦与土壤微生物研究

天昊生物创新型Accu16S^®细菌和AccuITS^TM真菌绝对定量测序服务部分客户文章列表：

• 盘点 | 天昊生物专利技术--Accu16S细菌与AccuITS真菌绝对定量测序客户文章汇总（医学篇）；

• 盘点 | 天昊生物专利技术--Accu16S细菌和AccuITS菌绝对定量测序客户文章汇总（环境农学篇）；

为什么天昊生物绝对定量能够

取得国际高水平杂志和客户的认可？

一、现阶段常规扩增子相对定量测序技术存在的不足：

1、常规微生物扩增子测序的数据在通过抽平后，只能获得微生物群落组成的相对比例，这种处理造成了样本微生物实际数量信息的丢失。而只考虑相对比例，不考虑绝对数量上的差异，将无法真实反映样本中实际菌群的组成状态，在与表型数据进行关联分析时，可能会推导出错误结论。

2、目前研究常用qPCR绝对定量和常规扩增子测序的联合策略来获得菌群绝对丰度和微生物群落结构，但是这就需要使用两个实验平台、两份样本及两次实验操作进行检测。而且qPCR绝对定量技术对样品质量的要求较高，尤其对PCR抑制剂敏感，而这又是土壤和肠道粪便等样本无法完全去除的，进而造成了系统性实验误差，导致结果不够准确。

二、天昊生物创新型Accu16S®细菌和AccuITSTM真菌绝对定量测序服务技术原理：

天昊生物绝对定量测序技术，通过向样品DNA中添加一定量人工合成Spike-in内参标准品序列，进行扩增子文库构建及二代高通量测序，再根据内参标准品测序序列数及绝对拷贝数绘制标准曲线，终计算出样本中OTU/ASV序列对应微生物菌群的绝对拷贝数。

三、技术优势：

我们的绝对定量测序方法，基于一个高通量测序平台，一个样本和一次检测，便可同时获得微生物扩增子的绝对定量结果、相对定量结果，以及两种定量的对比分析结果，可谓“一次检测，三种报告内容”！可以完全避免qPCR绝对定量所面临的引物优化、额外样本需求及额外检测操作带来的系统误差大、样本管理难、检测通量小和检测效率低等缺点，可以同时获得样本中总菌的绝对定量数据、优势菌种的绝对定量数据，测序结果更加真实，客观还原菌群结构和丰度比例，并且排除样本中的PCR抑制剂干扰，无样本偏差可直接比较结果。

往期相关链接：

• 天昊生物—微生物绝对定量测序行业领跑者；

• 盘点 | 天昊生物专利技术--Accu16S细菌与AccuITS真菌绝对定量测序客户文章汇总（医学篇）；

• 盘点 | 天昊生物专利技术--Accu16S细菌和AccuITS菌绝对定量测序客户文章汇总（环境农学篇）；

• “砥砺四载，满誉而来”！天昊微生物绝对定量测序“一作昊课堂”讲座开始啦！；