美拉德反应（Maillard Reaction）是广泛存在于食品工业的一种非酶褐变反应，是羰基化合物（还原糖类）和氨基化合物（氨基酸和蛋白质）间的反应，经过复杂的反应终生成棕色甚至是黑色的大分子物质类黑精或称拟黑素，故又称羰氨反应。由Maillard反应形成的蛋白质-多糖共聚物可用作乳液系统中的新型乳化剂。然而，人们对Maillard共聚物对肠道菌群调节的认识仍然有限。

近日，来自南京农业大学食品科技学院曾晓雄教授课题组的研究人员在《Food Hydrocolloids》杂志上成功发表论文。该研究利用乳清分离蛋白（WPI）与阿拉伯树胶（GA），通过干加热法聚合形成了新型乳化剂（WPI-GA-C），并利用天昊生物16S扩增子测序技术，深入探讨了WPI-GA-C乳化剂对人体肠道菌群的影响。

英文题目：Characterization of whey protein isolate-gum Arabic Maillard conjugate and evaluation of the effects of conjugate-stabilized emulsion on microbiota of human fecal cultures

中文题目：乳清蛋白分离胶Arabic Maillard共聚物的表征及结合稳定乳液对人粪便培养微生物群的影响评估

期刊名称：Food Hydrocolloids

影响因子：11.504 (一区Top)

发表日期：2023-1

研究背景

乳化剂可用于稳定和确定乳液的功能属性。一些合成或天然分子，如小分子表面活性剂，磷脂，蛋白质和多糖是食品中常见的乳化剂。近，随着消费者对清洁标签产品的需求不断增加，蛋白质和多糖等天然乳化剂的开发已成为食品工业的焦点。然而，大多数蛋白质对某些因素敏感，而一些多糖由于其表面活性差和高亲水性而不适合作为乳化剂。物理、化学或酶修饰已被用于解决蛋白质和多糖作为乳化剂的局限性。在这些修饰中，在受控的Maillard反应条件下将蛋白质与多糖偶联是一种天然、无毒和简便的方法，可以改善其乳化特性和其他功能特性。基于氨基酸和游离羰基之间的反应，蛋白质和多糖共价结合，从而改变一些重要的食品性质。据报道，共聚物的功能特性包括溶解度、包封效率、乳化能力和稳定性得到改善，而包括抗氧化剂、抗菌、益生元和抗高血压活性在内的生物学功能得到增强。

用于Maillard偶联的蛋白质和多糖可从多种来源获得。在营养上，乳清比许多其他动物或植物蛋白更有价值，是特殊营养配方中的首选。乳清分离蛋白（WPI）是从乳清中提取的纯蛋白形式，具有营养价值高、易消化、生物相容性好等优点，在食品工业中可广泛用作乳化剂、发泡剂、胶凝剂或包封剂等功能成分。特别是，WPI由于其两亲性而被认为是稳定乳液的良好乳化剂。据报道，通过专门增加肥胖动物中有益双歧杆菌的数量，摄入WPI可对新陈代谢和肠道稳态产生积极影响。然而，未修饰的乳清蛋白容易受到热量、pH值和盐浓度的影响，导致浊度和沉淀等不良特征。因此，寻求合适的改性方法来改善WPI的功能特性是必要的。已经尝试通过Maillard反应结合蛋白质和多糖来扩大WPI的应用。阿拉伯胶（GA）是一种亲水性多糖，含有复杂的多糖成分和少量蛋白质。GA良好的乳化性能使其常用于生产风味水包油乳液。此外，其与WPI的共聚物作为营养保健乳液的乳化剂已成功制备，并显示出提高包封生物活性成分生物可利用性的能力。作为安全的膳食纤维之一，GA不会在肠道中消化，但可以到达结肠，在那里它被微生物群发酵以产生短链脂肪酸（SCFA）。GA被证明是一种双歧杆菌膳食纤维，可以选择性地调节健康受试者中乳酸菌和双歧杆菌的比例。因此，补充GA可以通过改变结肠细菌的蛋白水解到糖解发酵模式来改善人类健康。由于WPI和GA都具有良好的乳化特性和改善肠道菌群的潜力，因此它们可以作为设计功能性Maillard共聚物的有希望候选者。

饮食可以塑造肠道菌群的组成，肠道菌群在宿主的健康中起着关键作用。具有理想结构和特性的基于乳液的系统通常用于封装和输送作为人类饮食重要成分的生物活性物质，因此乳液中的各种成分可能对肠道菌群产生积极或消极的影响。乳化剂是乳液配方中重要的成分之一，然而，一些乳化剂如羧甲基纤维素（CMC）和卡拉胶可以直接改变人体微生物群组成并促进肠道炎症。因此，在设计乳液系统时，重要的是要确保所选的乳化剂不会对肠道菌群或宿主产生不利影响。基于蛋白质-多糖共聚物的乳化剂在食品生物活性成分的封装、保护和递送方面显示出巨大的潜力。特别是，Maillard共聚物的较低消化率允许肠道菌群发酵的大多数底物进入结肠，包括碳水化合物和蛋白质底物。这些残留的糖复合物可以被肠道菌群代谢，然后影响宿主健康。近的研究推进了Maillard糖化蛋白与肠道菌群的相互作用。使用人粪便接种物的体外研究表明，肌原纤维蛋白的消化糖基化与肠球菌、多雷氏菌、埃希氏菌-志贺氏菌和假单胞菌呈负相关，对肠道健康具有潜在的积极影响。通过减少蛋白水解细菌的数量，鱼蛋白的糖基化还显著改变了体外粪便发酵期间发酵代谢物和肠道菌群的概况。这些研究建立了Maillard糖化蛋白对肠道菌群组成影响的更全面的理解。目前，蛋白-多糖Maillard共聚物作为膳食乳化剂的乳液系统对肠道菌群的影响尚未完全阐明，这些共聚物的营养和健康影响需要更广泛的研究。

因此，本研究的目的是基于食物蛋白质和多糖之间的相互作用制备一种新型乳化剂，并研究结合稳定乳液对人体肠道菌群的影响。首先，采用干加热法制备WPI和GA的共聚物；其次，通过测量一系列理化指标来评估其分子特性。后，通过体外发酵研究了乳化剂在乳液体系中对肠道菌群组成的影响。这项工作有望加深对用作乳化剂的蛋白质-多糖共聚物的功能特性的理解。

研究方法

本研究采用干加热法制备WPI-GA Maillard共聚物。取适量的WPI和GA以1：1的重量比溶于去离子水中，室温搅拌6h。将所得粉末分别在相对湿度为79%和温度为60ºC的干燥器中孵育1、2、3、4、5和6天。之后，将样品冷冻干燥以得到WPI-GA共聚物。此外，还设置了WPI和GA（WPI-GA-M）、天然WPI和干加热WPI（WPI-H）混合物的样品进行比较。每种处理重复三次。

Maillard共聚物的表征包括对颜色和褐变指数（BI）的测量。另外利用电子鼻检测挥发物。电子鼻包含10个金属氧化物气体传感器（W1C，W5S，W3C，W6S，W5C，W1S，W1W，W2S，W2W和W3S），指示不同类型的挥发性成分。此外还进行了接枝度（DG）和SDS-PAGE分析。并且进行了傅里叶变换红外光谱、本征荧光光谱和圆二色性光谱分析。

乳液的制备是由水溶液、橄榄油和优化的WPI-GA Maillard共聚物（WPI-GA-C）组成。

乳液体外消化基于体外胃肠道模型进行。体外粪便处理过程和发酵是由4名健康成年人（两名男性和两名女性，年龄在23-30岁之间）捐赠的新鲜粪便，他们在过去三个月内宣称不吸烟和没有抗生素治疗。将来自每个志愿者的等量（湿重）新鲜粪便混合。将预处理的上清液当作粪便菌群接种物，即未发酵的原始对照（OR）。将营养生长培养基上按比例混合的粪便上清液和乳液作为处理发酵样本（EMU）。以营养生长培养基上含有粪便上清液（在没有WPI-GA-C但含有橄榄油）作为空白对照（BLK）。将上述分组样本送上海天昊生物公司进行16S rDNA的V3-V4区扩增子测序，对其肠道菌群进行分析。

研究结果

研究首先对WPI-GA Maillard共聚物的特性表征进行了系统分析。实验分别从颜色和BI的变化、挥发性特性的变化、DG分析、SDS-PAGE分析、傅立叶变换红外分析、本征荧光光谱分析、二级结构中的CD分析以及WPI-GA-C及其稳定乳液在消化后的终去向多方面进行了分析，多方面检测证实了Maillard共聚物的形成。

随后实验分析了WPI-GA-C稳定乳液对人体肠道菌群的影响。如图1所示，稀疏曲线（图1A）和香农1曲线（图1B）随着序列数量的增加趋于平坦，表明测序数据充足，可以反映大部分微生物信息。聚类树用于描述和比较样本之间的异同。分支越近，样本的肠道菌群组成就越相似。如图1C所示，OR、BLK和EMU组位于不同的分支上，表明不同组之间的微生物群组成存在显著差异。PCA可以根据ASV的相对丰度在二维坐标图上反映样品之间微生物组成的差异。如图1D所示，横坐标（PC1）和纵坐标（PC2）是两个主要成分，可以分别解释样品间大差异的86.3%和12.1%。EMU组与其他组明显分离，表明添加WPI-GA-C对肠道菌群组成表现出显著影响。此外，根据维恩图结果（图1E），OR，BLK和EMU组中分别检测到392和106以及106个独特的ASV。总体而言，结果表明，EMU组的肠道菌群与OR或BLK组的肠道菌群显著不同。

图1、WPI-GA-C稳定乳液对人体肠道菌群结构的影响。（A）稀有曲线。（B）香农-维纳曲线。（C）样本聚类树。（D）主成分分析。（E）ASV的维恩图。（原文图4）

实验进一步在门和科水平上研究了细菌群落的相对丰度。如图2A所示，所有组的肠道菌群主要由厚壁菌、拟杆菌、变形杆菌和放线菌组成。对于OR组，厚壁菌（∼55.5%）、拟杆菌（∼34.5%）、变形杆菌（∼6.0%）和放线菌（∼1.6%）是门水平上常见的细菌。这与健康的人类结肠微生物群落组成一致，表明粪便样本未被污染。体外发酵24 h后，BLK组和EMU组变形杆菌和放线菌相对丰度增加，拟杆菌组和厚壁菌组相对丰度降低。通常，变形杆菌的大量增殖可以反映肠道菌群落的不稳定结构（生态失调），并作为体内疾病实验的潜在诊断标准。然而，体外实验中变形杆菌相对丰度的增加可能与培养条件有关，尤其是碳源。在以多糖为碳源的系统中，拟杆菌和厚壁菌是主要的细菌群落，在门水平上发生变化，因为这两个门可以分解和利用多糖。低分子碳水化合物（如葡萄糖）作为碳源通常用于发酵非多糖物质。与BLK组相比，EMU组的F/B比显著降低，表明WPI-GA-C有潜力通过调节微生物群组成成为功能性抗肥胖成分。值得注意的是，在所有组中，EMU组显示出高水平的放线菌，其中含有以双歧杆菌为代表的各种促进健康的益生菌。在科水平（图2B），与BLK组相比，添加WPI-GA-C显著提高了双歧杆菌科（∼26.2%）、拟杆菌科（∼13.5%）和卟啉菌科（∼1.2%）的相对丰度，但降低了前蝶科（∼6.5%）和荆芥科（∼3.8%）的相对丰度。这些结果表明，以WPI-GA-C为乳化剂的乳液对肠道菌群显示出更好的调节效果，并且可能通过促进有益微生物群的生长来帮助改善人体健康。改善肠道菌群的原因可能是结合物增强了碳水化合物的发酵。糖基化过程可能会增加结肠中可用蛋白质的量。体内研究表明，蛋白质的糖基化可以抑制蛋白水解细菌对蛋白质部分的使用，从而提供潜在的健康益处。此外，当共聚糖是益生元碳水化合物时，由于益生元碳水化合物部分赋予的选择性靶标，该蛋白质可能主要被益生菌用于合成代谢过程。难消化的多糖如GA可以将碳水化合物发酵过程转移到结肠的更远端区域。结肠中难以消化的碳水化合物的丰度是影响细菌代谢途径的重要因素，它可以促进使用含氮底物进行合成代谢（即生物合成）过程（主要是蛋白质合成）和益生菌生长。结肠中益生菌丰度的增加会导致高水平的促进健康的糖解发酵代谢物（如SCFAs），这反过来又降低了pH值并限制了致病物种的生长，改善了肠道菌群组成。

图2、WPI-GA-C稳定乳剂对门和科水平肠道菌群落变化的影响。（A）肠道菌群在门水平上的相对丰度。（B）科水平上肠道菌群的相对丰度。（原文图5）

使用基于ASV的LEfSe分析进一步评估了WPI-GA-C稳定乳液对肠道微生物组组成的影响。分析了BLK和EMU组中相对丰度超过0.1%的ASV，以确定显著改变的肠道菌群。如图3所示，不同颜色的条形代表LDA得分的不同ASV，12个具有显著高丰度的优势ASV与热图一起显示。普雷沃氏菌（ASV43、ASV42和ASV68）和变音菌（ASV30）是BLK组中的代表菌属，而WPI-GA-C稳定乳剂主要促进拟杆菌属（ASV54、ASV171、ASV193、ASV188和ASV146）和双歧杆菌（ASV16和ASV48）。拟杆菌属菌株可以代谢复杂的多糖，并被广泛认为是治疗肠道结肠炎、代谢紊乱和免疫功能障碍的潜在益生菌。拟杆菌属对宿主免疫调节、生理和代谢稳态的有益作用已在几种动物模型中得到证实。在本研究中，WPI-GA-C稳定乳液显著促进卵形拟杆菌被证明可有效抑制葡聚糖硫酸钠相关的炎症活化，改善结肠炎和刺激上皮恢复。双歧杆菌属的功能属性包括抗肿瘤作用、调节免疫功能和对病原微生物的保护。作为一种商业使用的双歧杆菌物种，长双歧杆菌被认为在健康中起着重要作用，并在结肠炎治疗、恢复受干扰的肠道菌群和压力管理方面显示出有希望的结果。这些结果表明，补充WPI-GA-C（由食物蛋白质和多糖之间的Maillard聚合产生的新型乳化剂）显示出通过促进有益细菌生长来改善人类健康的潜力。

PICRUSt是一种预测肠道菌群功能分析的实用方法。PICRUSt预测的不同组间功能差异发现，与BLK组相比，18个功能模块（增加9个，减少9个）发生显著改变。WPI-GA-C稳定乳液引起的肠道菌群改变途径主要涉及代谢途径（“半乳糖代谢”、“硫辛酸代谢”、“牛磺酸和次牛磺酸代谢”）和生物合成途径（“万古霉素组抗生素的生物合成”、“链霉素生物合成”、“鞘糖脂生物合成：乳酸和新乳糖系列”、“继发胆酸生物合成”和“初级胆汁酸生物合成”）。在受影响大的途径中，半乳糖代谢属于典型的碳水化合物代谢。之前的一项研究表明，富含不易消化碳水化合物的饮食干预可以通过丰富碳水化合物分解代谢的途径来改善微生物生态失调并将微生物群转变为更健康的结构（例如，促进含有碳水化合物发酵基因的双歧杆菌的增殖）。此外，WPI-GA-C稳定的乳液显著富集了与胆汁酸生物合成相关的途径，这可能有助于从胆固醇合成原胆酸，从而降低血清总胆固醇水平。因此，WPI-GA-C可能是乳液中的功能性乳化剂，通过调节肠道菌群来促进宿主健康。然而，需要做更多的工作来确定WPI-GA-C，肠道菌群与宿主健康之间的关系。

图3、（A）ASV水平上肠道菌群的线性判别分析（LDA）（LDA评分>3.5）。（B）基于LDA的BLK组和EMU组之间具有显著差异的ASV相对丰度热图。（C）相应的细菌分类群信息（门、科、属和种）。（D）KEGG肠道菌群功能预测，BLK组和EMU组之间存在显著差异。（原文图6）

研究结论

本工作通过Maillard反应制备了WPI-GA-C作为乳化剂。多种分析方法证实，WPI-GA-C主要由分子间共价结合形成，糖基化后WPI的二级和三级结构发生显著变化。本研究还检测了WPI-GA-C稳定乳剂对肠道菌群组成的影响。结果表明，WPI-GA-C稳定乳剂能显著调节肠道菌群的组成和丰度。在门水平上，WPI-GA-C稳定乳液降低了F/B的比例，而增加了放线菌的相对丰度。在物种水平上，WPI-GA-C稳定的乳液显著富集了卵形拟杆菌和长双歧杆菌。功能预测分析表明，WPI-GA-C稳定乳液与代谢和生物合成功能密切相关。因此，作为乳液制剂中重要的成分之一，通过Maillard反应制备的新型乳化剂有望改善乳液的功能特性并促进人体肠道菌群的健康变化。这些结果表明，Maillard反应制备的新型乳化剂具有促进人类肠道菌群健康变化的潜力，这对于设计使用蛋白质-多糖共聚物作为乳化剂的乳液递送系统具有重要意义。

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