胃癌（GC）是一种高度侵袭性恶性肿瘤，2020年全球约有76.9万人死于胃癌。免疫检查点阻断（ICB）为胃癌免疫治疗的新时代铺平了道路。然而，并不是所有胃癌患者对新辅助ICB都有反应。因此，有必要探索潜在的机制和相关的标志物，以筛选可能受益于免疫治疗的胃癌患者。

肿瘤微环境（TME）在胃癌对免疫治疗的反应中起着重要作用。既往研究往往通过组织块（bulk）样本的实验或数学模型探讨了胃癌TME的特征。然而，胃癌的TME是复杂且具有异质性的，基于bulk样本的实验会掩盖不同细胞群的特征。因此，有必要阐明ICB治疗过程中胃癌患者TME的分子和细胞图谱以及它们的动态和功能特征。尽管单细胞RNA测序（scRNA-seq）已被用于研究胃癌肿瘤及正常组织的转录异质性，然而很少有研究关注胃癌患者ICB治疗中TME的细胞多样性和动态变化。

2023年，郑州大学附属肿瘤医院肿瘤内科刘莺主任团队与普外科赵玉洲主任团队合作在Frontiers in Immunology（IF: 8.786）杂志发表新研究论文，对5例局部晚期胃或胃-食管结合部（GC/GEJ）腺癌患者经4个周期的新辅助治疗（化疗联合抗PD-1，mFOLFOX6 + camrelizumab）前后的肿瘤样本进行scRNA-seq，发现CD8+ T细胞的高干扰素γ（IFN-γ）特征能够预测胃癌对新辅助免疫治疗联合化疗的反应。同时也揭示了新辅助治疗中肿瘤间和肿瘤内的异质性及不同类型细胞的转录变化。值得一提的是，天昊生物有幸参与了本研究中的scRNA-seq实验及部分分析工作，公司的田飞博士作为共同一作参与该工作。

主要研究结果

1. 新辅助治疗期间GC肿瘤的单细胞转录组分析

在2019年7月至2021年2月期间，60名患者参加了试验。终52例（86.7%）患者接受了D2根治性胃切除术，具有可评估的病理肿瘤反应。52例患者中有5例（9.6%）达到病理完全缓解（pCR），11例（21.2%）患者经历了接近pCR。结果显示，camrelizumab联合mFOLFOX6作为局部晚期GC/GEJ腺癌的新辅助治疗，抗肿瘤效果显著增强。

作者获得了5例新辅助治疗前和治疗中患者的肿瘤组织，所有患者R0切除，1例达到pCR, 1例达到肿瘤病理消退级（TRG）1级。对这些位置相应的配对肿瘤样本（n = 10）利用10x Genomics Chromium平台进行scRNA-seq（图1A）。质控后共获得35884个细胞，根据相应的标记基因表达在治疗前（PT）和治疗中（OT）样本中共鉴定出10种主要细胞类型（图1B-E）。所有免疫细胞在治疗前或治疗中均有浸润差异，体现了胃癌患者间的细胞异质性（图1F）。

鉴于当前的scRNA-seq队列的样本量有限，作者利用去卷积算法CIBERSORTx来模拟细胞类型特异性的基因表达谱，并预测bulk RNA-seq队列中当前scRNA-seq揭示的每种细胞类型的丰度。结果发现，PT和OT样本中上皮细胞的比例都更高，而与PT样本相比，OT中的髓细胞和成纤维细胞有显著变化（图1G）。Bulk测序结果表明与scRNA-seq中的细胞比例有一定程度的一致性。

图1 联合治疗期间GC微环境的scRNA-seq分析

2. CD8+ T细胞的IFN-γ特征预测了对新辅助治疗的有效反应

T细胞（n = 11086）是GC患者肿瘤中常见的免疫细胞类型。对这些T/NK细胞进一步聚类发现了11个亚群（图2A），虽然PT和OT样本的T细胞亚群大部分相同，但OT样本中CD4 CXCL13和CD4 TCF7细胞主要富集，PT样本中CD8 CXCL13细胞富集（图2B, C）。

在CD8+ T细胞的三个亚群中，CD8 CXCL13细胞表现出高表达的抑制性受体（CTLA4, PDCD1和TIGIT）和细胞因子/效应物（CXCL13, GNLY和GZMA），表明CD8 CXCL13中细胞毒性和耗竭状态并存（图2D）。CD8 CXCL13细胞比CD8 GZMK和CD8 HSPA1A细胞具有明显更高的细胞毒性和耗竭特征（图2E, F）。对PT和OT样本间CD8+ T细胞差异表达基因富集分析发现OT样本中上调的基因富集在p53和IL2 STAT5通路中，而PT样本上调的基因与IFN-γ/α反应相关（图2G）。

相应地，进而发现PT样本中的CD8+ T细胞的IFN-γ特征表达更高（图2H）。有趣的是，与TRG2-3组相比，TRG0-1组患者在基线样本中的CD8+ T细胞或所有T细胞亚群中IFN-γ评分显著更高（图2I, J）。更重要的是，bulk测序数据显示TRG0-1组和TRG2-3组IFN-γ特征的结果一致（图2K）。这些结果表明，IFN-γ评分更高预示着对联合治疗具有更好的响应。

图2 治疗过程中CD8+ T细胞表达特征的变化

3. 轨迹分析揭示了CD8+ T细胞在治疗过程中的动态变化

为了揭示PT和OT样本中CD8+ T细胞的动态功能变化，利用Monocle 2算法对CD8+ T细胞进行拟时序分析（图3A）。结果显示该轨迹路径始于CD8 CXCL13细胞，其次是CD8 GZMK细胞，后是CD8 HSPA1A细胞（图3B）。沿着轨迹CD8+ T细胞的耗竭特征明显减少，而细胞毒性特征尽管终减少，但相对于耗竭特征具有更高分数（图3C, D）。事实上，PT样本中CD8+ T细胞的细胞毒性和耗竭评分明显高于OT样本（图3E, F）。这些数据表明治疗期间CD8+ T细胞的变化在拟时和真实时间进程中是一致的。另外对CD8+ T细胞与轨迹相关的转录变化进行分析，发现CD8+ T细胞的三簇可分为3个阶段，并具有不同的信号通路富集（图3G）。

图3 轨迹分析揭示了CD8+ T细胞在治疗过程中的动态变化

4. 肿瘤内上皮细胞对联合治疗的转录反应

作者重新聚类了6157个上皮细胞，在GC肿瘤中发现了7种亚群（图4A-D）。对所有细胞亚群的CIBERSORTx分析发现，治疗后bulk样本中的杯状细胞、化生干样细胞和增殖细胞显著减少，而主细胞显著增加（图4E）。为了揭示上皮细胞在治疗反应中的转录变化，分析了PT和OT样本中的差异表达基因（图4F），通路分析显示治疗后MYC靶点和氧化磷酸化上调，TNF-α信号和IFN-γ响应下调（图4G）。

此外，通过推断拷贝数变异（CNV）分析来区分恶性和非恶性上皮细胞。结果显示，与随机选择的T细胞相比，大多数上皮细胞表现出相对相似的拷贝数增加或损失（图4H）。上皮细胞具有相对更高的CNV分数，与T细胞聚类差异明显（图4I, J），说明肿瘤来源的上皮细胞主要富集在这些样本中。

图4 GC生态系统中上皮细胞对治疗反应的转录变化

5. 肿瘤内成纤维细胞对联合治疗的转录反应

癌症相关成纤维细胞（CAFs，n = 4299）在重新聚类分析中显示出两种不同的亚群（图5A）。OT样本中出现的一群高表达CFD、DPT和各种趋化因子（包括CXCL12和CXCL14，图5B），这一特征与胰腺癌中描述的炎性CAFs （iCAFs）相似。分布在PT和OT样本之间的亚群具有RGS5和ACTA2的高表达，这与肌成纤维细胞CAFs （myCAFs）相似（图5B）。这些结果表明GC中的CAF具有与其他癌症相似的亚群。CIBERSORTx分析也证实，OT样本中的iCAFs显著增加，而myCAFs在PT和OT样本中没有明显变化（图5C）。我们的分析还发现了myCAFs和iCAFs中大量的差异表达基因（图5D）。myCAFs中RGS5和ACTA2表达上调与TCGA和GEO数据集中GC患者的总生存期较差相关（图5E）。

图5 两种不同的CAFs亚型在GC生态系统中表现出转录差异

6. 新辅助治疗期间GC TME中复杂的细胞-细胞相互作用

为了揭示治疗过程中细胞-细胞通信的变化，我们使用CellPhoneDB来识别配体-受体对和主要细胞群之间的分子相互作用。考虑到CD8+ T细胞在免疫治疗应答中的重要作用，我们在PT和OT样本的TME中探索了上皮细胞与三种CD8+ T细胞亚群之间的相互作用。值得注意的是，在PT样本的上皮细胞和CD8+ T细胞中，CD74和相应的受体（APP、COPA和MIF）显著表达（图7A）。在OT样本中，新鉴定出CXCR6-CXCL16和EGFR-TGFB1对，上皮细胞和CD8+ T细胞之间CD74受体减少（图7B）。这表明胃癌联合治疗可以重塑肿瘤和CD8+ T细胞之间的通讯。

此外，我们发现巨噬细胞与CD8+ T细胞之间的通讯增加（图7C, D）。值得注意的是，在PT和OT样本中，ANXA1- FPR1/2/3和ICAM蛋白广泛表达，并介导了巨噬细胞与CD8+ T细胞之间的相互作用（图7C, D）。这些结果表明，抗炎和细胞间粘附的相互作用在治疗过程中保持稳定。

图6 联合治疗过程中CD8+ T细胞与上皮/巨噬细胞的细胞间相互作用

研究总结

这项研究使用scRNA-seq全面识别了胃癌在新辅助免疫治疗联合化疗治疗前和治疗中肿瘤内细胞转录组的动态景观。这项工作揭示了CD8+ T细胞的IFN-γ特征可能在预测GC患者对联合治疗的反应方面具有潜在价值。