常见的近端16p11.2缺失（16p11.2del）是多种神经发育障碍（NDDs）的风险因素，NDD具有不完全外显和可变的表现度。虽然对人类诱导多能干细胞（hiPSC）模型的研究已经证实了16p11.2del神经元细胞的神经元发育中断，但哪些基因导致了异常的细胞表型，以及什么决定了神经发育异常的外显率尚不清楚。

2023年3月3日，首都儿科研究所陈晓丽研究员团队在Brain（IF:15.255，医学一区Top）杂志在线发表了题为Haplotype-specific MAPK3 expression in 16p11.2 deletion contributes to variable neurodevelopment的研究论文。该研究发现了16p11.2缺失单倍型特异性MAPK3表达导致可变性神经发育。天昊生物有幸参与了本研究中的转录组测序及分析工作。

研究人员首先对16p11.2del队列进行分析，包括31名来自29个独立家庭的NDD儿童。在经过亲子检测的18例缺失中，9例是遗传的（4例是母系的，5例是父系的），9例是新生的。NDD表型广泛，与自闭症谱系障碍相比，其智力残疾/发育迟缓和癫痫的频率要高得多。

使用捕获测序，在16p11.2缺失队列中发现58个SNP横跨132kb完全连锁，形成只有两种剩余单倍型，次要等位基因（Del_H1）和主要等位基因（Del_H2）。不同的家族内剩余单倍型存在于16p11.2缺失队列的5个家系中，作者选择其中2个核心家系（分别包含性别相同、单倍型和神经发育表型不同的携带者）建立hiPSCs，这一条件有利于探索单倍型和神经元表型的关系（图1）。

作者利用PBMC成功重编程为hiPSCs，并进一步诱导为神经元细胞（NC，图1）。在16p11.2del和对照细胞之间，hiPSCs分化为神经祖细胞（NPC）的能力没有差异。在NC期，16p11.2del细胞体明显大于对照组，但在NPC期没有。

图1 hiPSC构建研究思路

接下来，作者比较了NPC和NC期16p11.2del和对照细胞的整体基因表达。与对照细胞相比，29个16p11.2基因中有20个在16p11.2del细胞中表达量显著降低，对差异基因进行通路富集后分析发现MAPK3被识别为hub基因（图2）。

图2 NPC和NC期转录组揭示16p11.2del扰乱基因表达

为了确定16p11.2del导致MAPK3表达减少是否具有功能性后果，作者通过WB证实了与对照二倍体细胞相比，16p11.2del NPCs显示ERK1水平显著降低，但磷酸化ERK1水平显著升高，表明ERK1活性异常上调。另外，通过挽救实验进一步证实了MAPK3单倍剂量不足导致了该系统中的分子和细胞表型。

作者注意到16p11.2del携带者家族间ERK1水平不同，而且ERK1蛋白在Del_H1 NPC中比Del_H2显著更低。MAPK3过表达后16p11.2单倍型不同也导致不同的NPC分子表型。在NC阶段挽救实验也证实了单倍型不同导致细胞形态和电生理特征的差异（图3）。

图3 NC阶段MAPK3表达挽救细胞形态实验

表达数量性状位点（eQTL）分析是确定目标基因表达与增强子SNP（eSNP）之间联系的有力方法。为了探索MAPK3表达变异的遗传基础，作者从GTEx数据库中提取了135个显著的MAPK3 eQTL SNPs，与58个剩余单倍型SNP交集发现25个次要等位基因与脑/神经元中MAPK3表达降低显著相关。进一步分析发现10个SNPs比对到3个调控元件（GH16J029925、GH16J029961、GH16J029972），这些eSNPs可能调控MAPK3表达。并通过扩增长单倍型特异性片段进行荧光素酶报告基因实验，证实了剩余单倍型（GH16J029972和GH16J029925）eSNPs可以通过增强子活性调控MAPK3表达。