青贮饲料是利用苜蓿等植物，经过切碎、厌氧发酵等处理制成的一种饲料。苜蓿青贮因其营养丰富、适口性好、利于长期保存等特点，成为家畜优质饲料来源之一。然而商业纤维素酶的使用增加了青贮成本，微生物在青贮发酵过程中的动态变化和潜在作用研究较少，并且无法准确提供样品之间目标微生物的丰度差异信息。

近期，来自郑州大学农业科学学院王雁萍教授课题组的科研人员，与河南省农业科学院畜牧兽医研究所合作，在国际发酵领域知名期刊《Fermentation》(IF= 5.123)上发表研究论文。该研究利用天昊微生物Accu16S^®绝对定量测序专利技术，评估了植物乳杆菌（ZZU203）、产纤维素酶甲基营养芽孢杆菌（CB）及其组合（ZZU203_CB）对青贮10天和60天后苜蓿发酵参数的影响。结果发现，ZZU203或ZZU203与CB的组合可作为潜在的青贮添加剂，提高紫花苜蓿的青贮品质。

英文题目：The Effect of Lactiplantibacillus plantarum ZZU203, Cellulase-ProducingBacillus methylotrophicus, and Their Combinations on Alfalfa Silage Quality and Bacterial Community

中文题目：植物乳杆菌ZZU203、产纤维素酶甲基营养芽孢杆菌及其组合对苜蓿青贮品质和细菌群落的影响

青贮是畜牧业作物贮存的重要技术。青贮饲料作为全球反刍动物饲料中粗饲料的主要来源，其发酵质量直接影响反刍动物的生长和生产。苜蓿是一种极好的饲料，在苜蓿青贮之前通常使用发酵添加剂来提高纤维降解，实现乳酸型发酵。然而，商业添加剂如纤维素酶的使用增加了青贮成本，而且酶的不稳定性也限制了其在青贮饲料中的应用。

青贮饲料中使用的细菌添加剂被称为接种剂，主要包括乳酸菌（LAB）等，它们主要负责青贮饲料的保存，因此研究广泛。然而，在青贮发酵过程中的一些细菌的动态变化和潜在作用很少被报道。

青贮饲料的发酵过程非常复杂，涉及微生物菌群，如LAB、腐败菌、酵母菌、霉菌和芽孢杆菌等。微生物群落的组成可直接影响青贮饲料质量，并进一步影响反刍动物的瘤胃微生物群。在过去的十年中，高通量测序极大地扩展了我们对苜蓿细菌群落的理解。该方法对于确定样品中不同微生物群的相对丰度很有价值，但它无法准确提供不同样品之间目标微生物绝对丰度差异的信息。近，本课题组开始使用天昊绝对定量测序方法来解决该问题带来的挑战。本研究的主要目的是评估LAB、产纤维素酶芽孢杆菌及其组合对苜蓿青贮饲料发酵参数、糖谱、木质纤维素降解和细菌群落的影响。

苜蓿用切割机切成小块。青贮前，切碎的苜蓿用以下方法处理：（1）不含接种剂（CK组）;（2）添加植物乳杆菌（ZZU203组）;（3）添加甲基营养芽孢杆菌（CB组）;（4）添加ZZU20和CB（ZZU203_CB组）。之后用真空袋中室温（10°C）下贮存10和60天。随后对其发酵参数和化学成分进行分析，包括pH值、氨氮含量（NH3-N）、有机酸含量（乳酸（LA）、乙酸（AA）、丙酸（PA）和丁酸（BA））、水溶性碳水化合物（WSC）、中性纤维（NDF）和酸性纤维（ADF）浓度、碳水化合物（葡萄糖、果糖、半乳糖和鼠李糖）含量。将新鲜或青贮样品（10 g）用90 mL无菌磷酸盐缓冲液以180 rpm振荡1小时。将溶液过滤通过四层医用纱布，滤液低温离心后收集沉淀，用于DNA提取。之后利用天昊Accu16S®绝对定量测序方法（V3-V4），对新鲜或青贮样品的细菌群落进行了分析。

青贮60 d后的发酵参数结果显示，接种剂（T）处理×青贮（D）的相互作用对所有发酵参数均有显著影响。青贮发酵的第一阶段是有氧呼吸期。时间越长，营养损失就越大。因此，在制作青贮饲料时，必须尽可能缩短有氧呼吸期。此外，迅速增加LA的含量，迅速降低pH值（<pH 5.5）可以抑制植物呼吸酶的活性，抑制霉菌和腐败菌的活性，从而降低发酵温度，减少蛋白质，干物质和能量的损失。随着氧气的排出，青贮饲料进入厌氧发酵，厌氧微生物逐渐成为细菌的优势群体，主要是LAB和丁酸菌。丁酸菌是青贮过程中的有害菌，不耐酸。如果LAB生长迅速，可以通过快速将pH值降低到4.7以下来抑制丁酸菌的生长。LA的快速积累和pH值的下降是评估青贮发酵质量的重要指标。本研究观察到接种ZZU203的青贮饲料（ZZU203组和ZZU203_CB组）的pH值低于CK组和CB组青贮饲料，表明接种ZZU203加速了青贮发酵过程。

苜蓿青贮饲料的非结构性碳水化合物含量检测结果表明，接种剂处理（T）、青贮天数（D）及其相互作用对苜蓿青贮饲料中葡萄糖、果糖、半乳糖和鼠李糖含量有显著影响。与非结构性碳水化合物含量相比，各组WSC、葡萄糖、半乳糖和果糖含量在青贮10 d后急剧下降，鼠李糖含量也下降。与青贮10 d相比，60 d时各组WSC和果糖含量显著下降。这与添加剂青贮组中的大量微生物有关，导致非结构性碳水化合物的大量消耗。

用不同添加剂处理后的苜蓿青贮饲料的结构碳水化合物组成结果发现，在青贮60 d期间，CK和CB组中NDF和ADF含量呈增加趋势，这可能是由于青贮过程中结构碳水化合物组分含量随着有机物的降解和消耗而相对增加。10 d时，ZZU203_CB青贮中NDF含量低，与CK青贮和CB青贮中NDF含量差异显著，但与ZZU203青贮中差异不显著。各组ADF含量无统计学差异。青贮60 d后，CK和CB组的NDF和ADF含量无显著差异。经LAB处理的青贮饲料NDF含量显著低于CK和CB青贮饲料。ZZU203的ADF含量低，与CK和CB青贮饲料不同。青贮过程中，结构碳水化合物降解的机理主要与结构碳水化合物的酸溶性和纤维分解酶对木质纤维素含量的直接水解有关。在ZZU203青贮饲料和ZZU203_CB青贮饲料中观察到低pH值，同一青贮饲料中记录的NDF含量高降低可归因于青贮过程中产生的有机酸降解木质纤维素，这与我们之前的研究结果相似，这与ZZU203使用结构糖产生酸的能力有关， 表明ZZU203青贮饲料的添加有利于NDF的降解。

图1、青贮60天过程中苜蓿中性纤维（NDF）（A）和酸性纤维（ADF）（B）的变化。（原文图3）

传统的相对定量16S-seq（RQS）已被广泛用于检测青贮饲料中的微生物群落。然而，在通过青贮过程或多次处理研究细菌群落动态变化时，RQS的唯一应用具有误导性，因为当细菌群落的总丰度不固定时，某个微生物群绝对丰度的波动可能不会引起分类单元相对丰度的显著变化。本研究青贮60 d后的细菌群落分析结果发现，细菌群落的α多样性如图2所示。青贮饲料中Chao1和Shannon指数的数值低于青贮前，这表明青贮过程中发生了大量选择，这是由于一些对青贮条件适应性好的细菌大量增加。与CK和CB青贮饲料相比，ZZU203和ZZU203_CB青贮饲料的细菌多样性有所下降。

图2、苜蓿青贮饲料中细菌群落的Chao1（A）和Shannon指数（B）的箱形图。（原文图4）

为了分析不同贮藏时间、不同青贮饲料处理中细菌群落的分布和结构，本研究进行了PCA分析（图5）。PC1 和PC2 分别可以解释总方差的 67.22% 和 27.29%。鲜料和青贮料细菌群落分离显著，差异显著，表明鲜料与青贮饲料微生物群落存在显著差异。所有青贮饲料分为4簇，表明外源添加剂和青贮时间对苜蓿青贮饲料细菌群落有显著影响。

图3、基于绝对定量测序结果的苜蓿青贮饲料细菌群落主坐标分析。（原文图5）

众所周知，参与青贮饲料LA发酵的大多数细菌属于乳酸菌属、片球菌属、魏斯氏菌属和肠球菌属。在这项研究中，新鲜苜蓿附生LAB丰度较低。因此，在青贮饲料中添加LAB使之成为加速LA发酵的优势菌，降低环境pH值，抑制有害微生物的生长，从而减少青贮饲料中蛋白质和干物质的损失，是提高青贮青贮饲料品质的有效途径。在10 d，CK青贮饲料表现出复杂的细菌群落组成。CB的细菌群落组成与CK青贮饲料相似，而不同之处在于CB青贮饲料中LAB的数量更高。接种CB的青贮饲料中LAB数量的增加是由于木质纤维素的降解和更多的WSC释放，用于青贮早期LAB的生长和利用。与其他典型LAB相比，LAB可以更好地利用原料中的营养物质，减少营养物质的损失。LAB数量越多，产酸速度越快，LA含量越高，pH值越低，减少了蛋白质的分解，降低了NH3-N的含量。在目前的研究中，ZZU203和ZZU203_CB青贮饲料在10和60 d时与CK相比，LAB的丰度增加（图4）。LAB是ZZU203和ZZU203_CB细菌群落的主要属（10 d时分别为96.88%和97.18%，在60 d时分别为98.27%和98.31%）（图4A）。两种青贮饲料之间LAB的相对丰度无显著差异。然而，在用绝对定量结果显示接种对细菌DNA总量的动力学和影响后，在10 d添加ZZU203和CB的组合青贮饲料中发现LAB丰度高（图4B），这表明组合CB添加剂对LAB的生长具有协同作用。然而，ZZU203青贮饲料的LAB丰度与60d时ZZU203_CB青贮饲料相比没有差异。本研究结果表明在CK青贮饲料中观察到10 d的哈夫尼菌属显著更高（表2），这部分解释了较高的pH值和NH3-N含量。接种ZZU203和ZZU203_CB后，该菌属丰度降低，说明添加ZZU203青贮饲料可有效抑制其生长繁殖。

图4、使用相对定量RQS（A）和绝对定量AQS（B）展示的苜蓿青贮饲料中细菌群落柱状图。（原文图6）

表2、使用10天和60天属的相对定量RQS和绝对定量AQS数据展示的苜蓿青贮饲料中的细菌群落。