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Nature Biotechnology强烈建议微生物组要用“绝对定量”,指出当前研究未普及微生物组绝对定量检测是“不幸的”
发布时间:2023-08-25

精确测量肠道菌群对理解其与人类健康的关系至关重要。然而,目前多数微生物组学的研究只关注了相对定量结果,忽略了样本微生物总量和转录水平的差异。越来越多的证据表明,测量肠道中微生物的“绝对丰度”,可以提供比相对定量更丰富的数据信息,能够纠正从相对定量数据中得出的一些错误结论。同时,样品处理中的实验偏差也会对微生物组的准确测量产生影响。系统性评估样品保存方法及不同储存温度对微生物组成的影响,对分析偏差产生的原因是必要的。但目前相关报道存在着结论不一致的情况,需要进一步加以研究明确。此外,将绝对定量检测引入到该评估过程中,可以更加准确对微生物的丰度进行测量,对于厘清样本保存液和储存温度等实验条件差异造成的系统性偏差也是十分必要的。


近期,发表在Nature Biotechnology上的文章,就从相对和绝对定量角度,系统性评估了微生物组检测在样品收集中引入的偏差。在本研究中,研究者分析了两种常见保存液和短期不同温度储存如何影响微生物相对和绝对丰度的。OMNIgene GUT OMR-200保存液在不同储存温度之间产生较低的宏基因组分类变异,而Zymo DNA/RNA Shield保存液得到较低的宏转录分类变异。绝对丰度定量揭示了保存方式导致的Bacteroidetes/Firmicutes比率不同的原因。基于这些结果,本研究建议将OMNIgene GUT OMR-200试剂盒用于现场研究,将Zymo DNA/RNA Shield试剂盒用于宏转录组学研究,并且强烈建议对微生物组进行绝对定量的测定。作者认为目前没有一种绝对定量的方法在微生物组学研究中被普遍使用,这是不幸的,因为微生物的绝对定量会防止由于只根据相对定量结果得出微生物和宿主生物学之间错误的人为相关性,并且会极大地影响微生物组的各种成分彼此之间以及对人类宿主影响的结论。

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英文题目:Quantifying bias introduced by sample collection in relative and absolute microbiome measurements

中文题目:在相对和绝对微生物组测量中量化样品收集引入的偏差



1、样本收集和研究设计

从来自美国加利福尼亚州的10名成年捐献者获得了粪便样本。为了评估储存温度和保存液选择对粪便微生物载量和微生物组成测定的影响,研究者将粪便分成有或没有保存液缓冲液 (OMNIgene GUT OMR-200收集管(DNA Genotek)或DNA/RNA Shield粪便收集缓冲液(Zymo Research))的样本。不含保存液缓冲液的样品立即在-80°C下冷冻;含有保存液的样品部分在-80°C下直接冷冻,部分在23°C或40°C下保存7天,然后储存到-80°C。这7个实验条件中的每一个都进行了三次重复,每个捐献者总共分成21份样本(图1)。

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图1、研究工作流程概述。



2、保存液和存储温度会影响宏基因组和宏转录组测量结果

研究者发现样本的菌群组成有相当大的差异,发现了使用保存液带来的系统性差异。并且高温储存会导致Zymo保存液中额外的群落变化 (图2)。

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图2、不同储存条件下样品的宏基因组特征。a,跨样本的15个丰富属的宏基因组相对丰度。由于文库制备失败,来自供体3 Zymo 40°C条件的重复2被排除在后续分析之外。b,宏基因组学每个条件下样本中三个丰富细菌门、病毒和真菌的相对丰度。中心点代表由GEE回归模型确定的估计平均值。c,跨样本的属水平的香农指数。d,样本的属水平丰富度。e,每种保存液不同保存条件之间的属水平Bray-Curtis差异。



3、保存液和存储温度对肠道微生物的绝对丰度影响

研究者使用针对细菌/古细菌16S rRNA基因的qPCR来测量不同保存液和温度条件下每个样品中16S rRNA的总拷贝数(图3)。

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图3、绝对丰度量化工作流程(原文图4)。


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图4、微生物组样品的绝对丰度量化。a,用细菌/古细菌16S rRNA基因的qPCR计算的每个样品每克干粪便的微生物总数。b,多形拟杆菌、大肠杆菌和粪肠球菌在生长培养基、OMNIgene或Zymo保存液储存后的总菌落形成单位(CFU)。接种后或在37°C下培养72小时后,立即对培养物进行铺板。在接种到OMNIgene或Zymo保存液后,未观察到任何分类群的CFUs。c,每个样品单位粪便克数中拟杆菌门和厚壁菌门在OMNIgene保存的样品(上图)和Zymo保存的样品(下图)中的总数。d,拟杆菌门与厚壁菌门数量的比率(原文图5)。


结果表明OMNIgene保存液可以比单独的标准提取方法更有效地裂解肠道细菌。当储存在Zymo保存液中时,DNA在更高的温度下可能更不稳定。OMNIgene保存液中的样品相较于立即冷冻的、没有保存剂的样品中放线菌门数量没有显著变化,但具有更高的拟杆菌门和厚壁菌门的总量,储存在Zymo保存液中的样品相对则具有更高的厚壁菌门和拟杆菌门的含量,而具有更低的放线菌总量。



4、结论及建议

本研究观察到保存液的选择对测量微生物载量有很大的影响,强调了样品处理选择对绝对测量的影响。此外,研究者发现绝对定量的使用可以识别究竟是哪些分类群对相对定量的比率结果产生了影响,证明了绝对丰度定量在揭示关键信息方面的重要性,而这些信息在相对丰度数据结果中是模糊不清的。目前,在大多数肠道微生物组研究中没有进行微生物丰度的绝对定量。然而,这些数据说明了绝对定量在检测个体间微生物总载量的差异和鉴定特定分类群的生长或消耗中具有非常重要的作用。

考虑到细菌载量和相关特征的重要性,如宿主生物学上的膜脂多糖剂量,以及微生物群落组装的重要性,本研究推测微生物总载量可能是疾病进展和治疗结果的重要生物标志物。作者预测未来的研究将通过测量绝对丰度,更好地关联微生物组和人类健康。这些结果和相关研究将成为指导大队列研究设计的佳实践,为荟萃分析中的跨队列比较提供信息,并使研究人员能够针对其特定的研究问题优化样本收集方法。





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