近日，电子科技大学医学院乐卫东、郑敏及杨露团队合作在Molecular Psychiatry杂志（IF：10.1，中科院1区）发表新研究Astrocytic Mettl14 depletion enhances cognitive function by attenuating astrogliosis via the DUSP1/MAPK pathway in APP/PS1 mice: targeting neuroinflammation in Alzheimer’s disease（APP/PS1小鼠星形胶质细胞Mettl14缺失通过DUSP1/MAPK通路减弱星形胶质细胞增生，从而增强认知功能：靶向阿尔茨海默病的神经炎症）。

在该研究中，团队使用了Mettl14条件性敲除APP/PS1小鼠模型（AD-cKO小鼠）来研究调节星形胶质细胞m6A水平对AD进展的影响。通过全面的组织学、生化和转录组分析显示，与APP/PS1对照小鼠相比，AD-cKO小鼠表现出更好的认知功能，同时星形胶质细胞增生减少，神经炎症减轻。基于MeRIP-seq和RNA-seq数据的联合分析（昊为泰提供技术服务），机制研究进一步表明，星形胶质细胞中Mettl14的缺失显著影响了炎症负调控因子DUSP1的表达，从而减轻了MAPK信号。这些研究结果表明，针对m6A调控因子（如Mettl14）的治疗策略可能是一种控制AD进展中神经炎症的有效方法。此外，该研究还强调了表观遗传调控作为治疗AD的新方法的更广泛潜力。

1.在APP/PS1转基因小鼠中，星形胶质细胞中的m6A水平升高

此前对人类样本的研究表明，在AD的进展过程中存在细胞特异性的m6A修饰。团队使用APP^swe/PS1^ΔE9转基因小鼠（一种经典的AD小鼠模型）检测了星形胶质细胞中的m6A水平。利用神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的免疫荧光染色（一种星形胶质细胞标志物）在3个月和9个月大的小鼠海马中与m6A免疫反应性共定位。结果表明，在3个月大的小鼠组中，野生型（WT）和APP/PS1小鼠之间没有显著变化（图1A、B），但在9个月大的APP/PS1转基因小鼠中，与年龄匹配的WT小鼠相比，GFAP阳性星形胶质细胞中的m6A免疫反应性显著增加（图1C、D）。

进一步培养了小鼠原代星形胶质细胞，并用细胞因子混合物和Aβ_1–42对细胞进行处理，以模拟APP/PS1小鼠星形胶质细胞所处的环境。通过m6A定量检测分析发现，无论是细胞因子混合物处理的原代星形胶质细胞（图1D、E），还是Aβ处理的原代星形胶质细胞（图1F、G），m6A水平都有显著提高。细胞因子混合物或Aβ_1–42处理的星形胶质细胞中检测METTL3和METTL14的表达情况，发现这两种甲基转移酶在这些星形胶质细胞中均上调，同时GFAP的表达也有所增加（图1H-K）。这些发现表明，在激活的星形胶质细胞中，m6A修饰异常增加，而AD期间星形胶质细胞中的调节机制仍很大程度未被研究。

图1 在体内和体外星形胶质细胞中m6A和m6A写蛋白增加对Aβ病理的反应

2.星形胶质细胞中敲除Mettl14能改善APP/PS1小鼠的空间记忆和学习能力的下降

为了获得海马星形胶质细胞特异性Mettl14敲除的小鼠，分别将GFAP启动子下表达Cre重组酶的AAV（AD-Mettl14-cKO小鼠）或对照AAV（即AD-CTL小鼠）以立体定向方式注射到6个月大的APP/PS1-Mettl14^f/f小鼠的海马中（图2A）。对EGFP的检测表明，AAV主要分布在小鼠的海马区星形胶质细胞中（图2B），从而导致小鼠海马区METTL14的表达降低以及m6A修饰减少（图2C-F）。

为了研究星形胶质细胞中Mettl14缺失对APP/PS1小鼠海马区功能的影响，初关注的是其对认知行为变化的影响。AD-Mettl14-cKO小鼠在Morris水迷宫测试中表现出比AD-CTL小鼠更强的空间学习和记忆能力。这种改善体现在找到平台的等待时间缩短（图2G-I）以及实验过程中目标交叉次数的增加（图2J）。此外，在Y型迷宫测试中，AD-Mettl14-cKO小鼠在交替三联体中的次数显著增加，表明工作记忆有所改善（图2K、L）。虽然观察到总臂进入次数有增加的趋势，但这种差异在统计学上并不显著（图2M）。此外，通过开放场地测试对运动和探索行为的评估显示，两组之间的表现没有显著差异，包括它们在实验中的平均速度（图2N、O）和移动的总距离（图2P）。这些发现表明，星形胶质细胞中METTL14调控的m6A甲基化水平的丧失导致了小鼠认知行为变化的改善。值得注意的是，这种改变不会影响AD-Mettl14-cKO小鼠的运动功能，这表明认知改善并未损害运动能力。

图2 星形胶质细胞中Mettl14区域特异性缺失小鼠的表征

3.星形胶质细胞特异性地敲除Mettl14蛋白会降低APP/PS1小鼠体内Aβ斑块负荷以及神经元树突/突触的退化

对Aβ斑块负荷的量化至关重要。因此，研究对AD-Mettl14-cKO和AD-CTL小鼠的Aβ斑块负荷进行检测，发现APP/PS1-Mettl14-cKO小鼠的斑块负荷显著降低，其特征在于斑块的大小和密度均有所减少（图3A-D）。还评估了两组小鼠之间的神经元树突复杂性，通过Golgi染色评估了半径在5-250微米之间的同心圆内的交叉点（分支点）数量、分支数量以及海马神经元的树突棘密度（图3E）。Sholl分析显示，与AD-CTL小鼠相比，AD-Mettl14-cKO小鼠的海马神经突的连接以及总树突长度发生了显著逆转（图3F）。同时，研究结果还表明，星形胶质细胞中由METTL14调控的m6A甲基化水平的丧失对海马神经元树突棘的密度有着重大影响（图3H），这一点从AD-Mettl14-cKO小鼠与AD-CTL小鼠相比总树突棘密度的显著增加中得到了证实（图3I）。进一步评估了树突棘的表型，发现细小、丝状和短小的树突棘数量显著增加，而蘑菇形树突棘的密度未见明显变化（图3J）。这些结果也为与AD-CTL小鼠相比，AD-Mettl14-cKO小鼠所观察到的行为变化提供了形态学基础，表明星形胶质细胞中Mettl14的缺失对Aβ介导的病理进程产生了显著影响。

图3 星形细胞Mettl14的区域特异性缺失影响APP/PS1小鼠海马神经元的Aβ病理和形态

4.Mettl14在星形胶质细胞中的缺失能够通过减少APP/PS1小鼠星形胶质增生减轻神经炎症

因为星形胶质增生是Aβ负载增加的脑部的一个典型特征，鉴于其在神经炎症和AD疾病进展中具有重要作用，研究试图了解Mettl14缺失对星形胶质细胞活动的影响。从AD-Mettl14-cKO小鼠和AD-CTL小鼠的脑切片中对GFAP和Iba-1进行染色，从而证明了星形胶质细胞和小胶质细胞的激活（图4A）。对获得的图像进行了详细的分析，以检测海马中一个已确定区域内的GFAP阳性面积。与AD-CTL小鼠相比，AD-Mettl14-cKO小鼠的GFAP阳性面积显著减少（图4B）。接下来，团队研究了激活的星形胶质细胞在斑块周围区域的形态变化，如图4C所示。对小鼠脑切片的整个海马区域进行了分析。Visiopharm软件自动识别所有表达GFAP的星形胶质细胞和Aβ阳性淀粉样斑块，然后对其进行自动标记。具体而言，研究结果表明在Aβ斑块附近星形胶质细胞的体积有所减小（图4D），并且在这些斑块周围星形胶质细胞的分支也明显减少（图4G）。

此外，还通过蛋白质印迹验证了其表达改变，并证实了另一种在AD中作为星形胶质细胞增生重要标志物的C3的表达，在AD-Mettl14-cKO小鼠中显著低于AD-CTL小鼠（图4C、D）。炎症细胞因子的增加是AD期间大脑中星形胶质细胞激活和神经炎症的有力证据。研究还评估了这两种小鼠模型大脑中炎症介质的水平。结果表明，与对照组相比，星形胶质细胞Mettl14缺失的小鼠大脑中的IL-6、TNF-α和MCP-1的水平显著降低（图4H-J）。这些体内数据表明，Mettl14介导的星形胶质细胞中m6A修饰的改变能够调节AD大脑中观察到的病理进展，特别是通过影响神经炎症。

图4 星形胶质细胞中Mettl14的缺失减轻APP/PS1小鼠星形胶质细胞激活和神经炎症

5.MeRIP-seq和RNA-seq分析揭示在体外和体内星形胶质细胞中Mettl14的缺失与神经炎症反应之间存在关联

前期已经观察到海马星形胶质细胞中敲除Mettl14可提高认知功能、减轻神经炎症，并降低了APP/PS1转基因小鼠大脑中的斑块负荷。团队进一步深入研究了与METTL14介导的脑部m6A修饰相关的通路。从AD-Mettl14-cKO和AD-CTL小鼠中收集了海马组织用于RNA提取，随后进行了MeRIP和RNA测序。注意到与对照相比，在AD-Mettl14-cKO小鼠中特定峰的甲基化水平在星形胶质细胞Mettl14敲除后显著变化（图5A）。这种m6A峰的减少，归因于海马星形胶质细胞中Mettl14的敲除，主要在mRNA的3' UTR区域观察到（图5B、C）。图表显示了AD-Mettl14-cKO和AD-CTL小鼠之间主要m6A共同结合基序的显著变化（图5D）。值得注意的是，转录组分析显示与AD-CTL小鼠相比，AD-Mettl14-cKO小鼠中与促炎反应相关的基因表达出现了显著变化。如火山图所示，AD-Mettl14-cKO小鼠中C3、H2-T23、H2-D1和Gbp2的表达显著下调，表明Mettl14的缺失抑制了这些小鼠的神经毒性表型转变（图5E）。

进一步分析发现，693个基因的差异表达（至少有两倍的变化）主要富集在细胞激活和炎症通路中，这是通过GO和KEGG分析得出的结论（图5F、G）。全局基因集富集分析表明，免疫效应物的正向调节和细胞因子受体相互作用在星形胶质细胞Mettl14敲除后存在显著富集，同时MAPK信号通路的负调控得到促进，而NF-κB信号通路则受到抑制（图5H-K）。考虑到大脑中的细胞多样性，团队旨在进一步阐明Mettl14缺失在星形胶质细胞中的作用及其潜在机制。因此，进一步使用CRISPR/Cas9系统构建了Mettl14基因敲除的星形胶质细胞系，并研究了Mettl14缺失对星形胶质细胞炎症反应的影响（图5I、J）。为了模拟AD小鼠体内的炎症环境，星形胶质细胞被暴露于细胞因子混合物以及Aβ_1–42中。结果表明，与体内实验数据一致的是，CRISPR/Cas9介导的Mettl14缺失显著降低了Mettl14 KO#1和KO#2细胞系中的C3、H2-T23和Serping1的表达（图5K-M）。这些发现进一步证实了体内证据，即星形胶质细胞中Mettl14的限制性表达可能在大脑中起到调节“刹车垫”的作用，在AD的进展过程中减少神经炎症的升级。

图5 MeRIP-seq和RNA-seq数据的生物信息学分析以及关键候选基因的体外验证

6.DUSP1作为METTL14介导的m6A修饰的关键靶点，通过MAPK通路调节星形胶质细胞激活

接下来，旨在确定Mettl14缺失在体内和体外所影响的关键靶点。进而分析了m6A峰与通过RNA测序确定的相应基因表达水平之间的相关性。这些基因被分为低甲基化-表达上调或低甲基化-表达下调两类，取决于减少的m6A峰是否与基因表达的增加或减少相关。在1636个减少的m6A峰中，观察到693个基因的表达发生了两倍的变化。具体而言，在APP/PS1-Mettl14-cKO小鼠中，与APP/PS1-对照小鼠相比，有194个基因被归类为低甲基化-上调，22个为低甲基化-下调（图6A）。GO分析显示，低甲基化-上调的基因主要参与细胞激活通路的负调控，包括MAPK和STAT信号通路、蛋白磷酸化和蛋白激酶活性，如图6B所示。这些通路在生物学过程GO条目中排名前10，按照其统计显著性（p值）排序。进一步的分析确定了六个关键基因—Nr2f2、Dusp1、Sfrp2、Cav1、Fbln1和Aida—它们在这些靠前的GO条目中频繁出现，且很可能参与了星形胶质细胞激活的负调控（图6B）。热图展示了这些基因的表达和m6A峰变化log2差异倍数值，强调了它们的重要性。并在体外验证了这六个基因的表达变化。其中，DUSP1在Mettl14基因敲除的星形胶质细胞中与野生型细胞相比，表达上调为显著（图6C）。基于体内测序数据和体外验证，DUSP1成为了METTL14介导的m6A甲基化的关键靶点，在星形胶质细胞增生的调节中发挥着关键作用。

总的来说，m6A修饰在翻译终止密码子附近以及3' UTR中富集，以调节mRNA的命运。DUSP1在其3' UTR中含有四个保守的m6A修饰位点（图6D），在星形胶质细胞中Mettl14缺失后表现出为显著的变化。YTHDF2是一种关键的m6A读取因子，优先识别经过m6A修饰的DUSP1 mRNA，并通过招募RNA消化酶或衔接蛋白来促进其降解，这一机制在癌细胞中已被观察到。在当前研究中，通过MeRIP-qPCR进一步证实了YTHDF2在星形胶质细胞中的作用，结果显示在DUSP1的3'UTR区域的三个不同位点存在显著的YTHDF2富集（图6E）。此外，用放线菌素D降解实验表明，在Mettl14基因敲除的星形胶质细胞中，DUSP1 的mRNA降解速度变慢（图6F）。

为了进一步确认YTHDF2在Mettl14基因敲除的星形胶质细胞中对DUSP1的转录后调控中的关键作用，用靶向YTHDF2的shRNA转染星形胶质细胞，这导致DUSP1水平显著增加，通过RT-PCR得到证实（图6G）。由于DUSP1是已知的丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）的抑制剂，而MAPKs是信号传导和炎症反应的关键分子。研究还发现，在Mettl14基因敲除的星形胶质细胞中，激活MAPKs（包括ERK和JNK亚族）的细胞因子混合物显著受到抑制（图6H、I），而野生型细胞和敲除细胞之间P38的激活情况没有显著变化。此外，为了确定在METTL14缺失的情况下，DUSP1在调节星形胶质细胞激活中的关键作用，使用siRNA抑制Mettl14基因敲除细胞系在细胞因子混合刺激下的DUSP1表达。研究结果表明，METTL14缺失显著降低了对细胞因子刺激的C3、IL-6和TNF-α的表达，并且DUSP1的敲低逆转了METTL14基因敲除所导致的基因表达抑制（图6J-L）。综上所述，这些结果表明，DUSP1作为METTL14介导的m6A修饰调控星形胶质细胞炎症反应的关键分子。

图6 Dusp1是Mettl14介导的m6A修饰通过MAPK途径调节星形胶质细胞激活的关键靶点

当前研究表明，抑制星形胶质细胞中的METTL14能显著改善APP/PS1小鼠的认知功能，并减轻星形胶质细胞的激活状态。从机制上讲，针对METTL14的干预会降低星形胶质细胞中的m6A水平，通过调节抗炎蛋白DUSP1的表达来缓解炎症反应，从而减轻阿尔茨海默病中的MAPK信号传导。