近日，来自四川大学轻工科学与工程学院的周荣清教授团队，在国际一区Top期刊Food Research International（IF=8, 一区Top）上发表了研究论文，题为“Synthetic and Natural Microbial Communities in High-temperature Daqu Production: Insights into Metabolic Pathways and Volatile Organic Compounds”，唐秋香助理研究员为第一作者。该研究利用昊为泰微生物AccuMetaG^®宏基因组绝对定量测序专利技术，系统研究了高温大曲微生物群落和代谢通路的特征，并探讨了合成菌群（SynMC）与传统微生物群落在代谢通路和挥发有机物（VOCs）生成上的异同。研究表明，尽管SynMC在代谢功能上与传统高温大曲群落高度相似，但在某些VOCs的形成上，合成群落与自然群落间存在显著差异。这一发现为优化大曲的生产过程并实现其工业化应用提供了新的思路和理论依据。

值得一提的是，在本研究论文的投稿过程中，审稿专家关注传统扩增子基因功能预测分析结果。而本研究创新性地采用昊为泰绝对定量AccuMetaG^®专利技术获得的宏基因组绝对定量数据换算得到的相对定量结果进行相互佐证，有效回复了审稿人提出的关键意见，为研究成果的发表提供了重要支撑。这种趋势也预示着微生物组学研究正朝着更加精准化、定量化的方向发展。

另外，该团队曾在去年就利用昊为泰Accu16S^®细菌绝对定量测序和AccuITS^TM真菌绝对定量测序专利技术，深入研究了三色酱曲的细菌和真菌群落动态变化情况，文章发表在食品领域顶刊上（项目文章（一区Top）| 四川大学周荣清教授团队利用微生物扩增子绝对定量测序等方法探讨三色酱曲微生物群落与代谢物的动态变化）。在祝贺周教授团队取得如此丰硕成果的同时，也让我们再一起看下本次利用宏基因组绝对定量方法发表的新研究成果。

中文题目：高温大曲生产中的合成与天然微生物群落特征：代谢通路与挥发有机物的见解

在线发表时间：2025年7月3日

本研究内容概要图

1.高温大曲中SynMC与传统微生物群落的代谢通路对比：通过宏基因组绝对定量测序分析，发现SynMC在代谢通路上与传统大曲微生物群落高度相似，尤其是在氨基酸生物合成和碳代谢通路方面。

2. 微生物群落对VOCs的影响：研究揭示了不同区域传统高温大曲与SynMC在VOCs组成上的差异，指出了酚类、吡嗪类和酯类化合物在不同产区的显著差异。

3. Bacillus在高温大曲发酵中的核心作用：Bacillus作为关键微生物，在大曲发酵过程中的代谢功能和生态适应性中起着核心作用。研究表明，Bacillus的丰度调控可以显著改变发酵群落的结构与功能表现。

4. SynMC的工业应用潜力：SynMC通过优化微生物群体间的相互作用，能够稳定高温大曲的生产过程，并有效提升产品的质量一致性。

高温大曲样本采集

传统的高温大曲样本来自三个核心生产区域：贵州金沙（JS）、贵州仁怀（RH）和四川泸州（LZ）的酱香型白酒主要生产商。所有样本均在标准化季节期间（2024年3月–5月）收集，以减少环境变化的影响。为了减少采样偏差，传统样本随机选自大规模生产批次。SynMC使用先前从优质高温大曲样本中分离出的优势功能验证菌株。SynMC强化的高温大曲样本按照前人方法制做。

理化性质检测及代谢谱检测

采用高效液相色谱法（HPLC）分析高温大曲样本中的有机酸。挥发性有机化合物（VOCs）通过气相色谱-质谱（GC-MS）分析，每个样本取1 g，使用内标物（辛酸甲酯）标定并进行分析。

微生物高通量测序与生物信息学分析

从样本中提取总基因组DNA，首先采用16S rRNA细菌（V3-V4区）和ITS真菌（ITS1区）扩增子测序对菌群结构进行分析，利用昊为泰微生物AccuMetaG^®宏基因组绝对定量测序专利技术，对微生物功能基因和代谢通路进行深入分析。

理化性质和有机酸分析

本研究首先对54个SynMC强化的高温大曲样本和39个来自酱香型白酒核心生产区（仁怀RH、泸州LZ、金沙JS）的传统高温大曲样本的理化特性进行了比较。总体上，强化样本与核心区样本之间的相似度较高，特别是在有机酸分析中，金沙区域的样本表现出较高的相似性。

图1. 高温大曲样本的理化性质和有机酸分析。（A）54个SynMC强化的高温大曲样本和39个传统高温大曲样本的理化性质相关性热图。大多数样本显示出较高的相关性，表明其理化性质相似。（B）理化性质聚类热图。糖化和液化能力较高的样本通常聚集在一起。（C）基于有机酸的样本相关性。大多数样本对呈统计学较高的显著相关性。（D）有机酸聚类热图显示仁怀样本通常含有较高浓度的乙酸、酒石酸、柠檬酸等有机酸，而金沙样本的浓度较低。

挥发性有机化合物分析

挥发性有机化合物的分析结果表明，SynMC样本与传统高温大曲样本在VOCs特征上有显著的相似性，尤其在仁怀区域，酚类和吡嗪类物质占主导地位，泸州样本以酮类物质为主，金沙样本则以酯类物质为主。

图2. 高温大曲样本的挥发性有机化合物谱。（A）基于挥发物的样本相关性，大多数样本对之间呈统计学高度显著相关。（B）核心区域样品中挥发物的差异丰度LEfSe分析。（C）SynMC样品中挥发物的差异丰度LEfSe分析。（D）Venn图显示SynMC样本与传统高温大曲样本之间的VOCs有部分重叠。

微生物群落的差异

本研究首先基于细菌和真菌扩增子测序发现，不同地区高温大曲的优势真菌属包括Thermomyes、Thermoascus、Aspergillus、Monascus、Rhizopus、Byssochlamys、Rasamsonia、Microascus和Pichia（图3A）。这些属在所有区域样本中占总真菌丰度的75%以上。真菌群落的相关性分析显示出明显的聚类模式（图3B）。金沙样本形成了一个独立的聚类，而仁怀样本则紧密地聚集在一起。泸州样本则与部分金沙样本更为相关，表明它们的真菌特征部分重叠。这些结果确认了真菌群落在区域上的强烈特异性。SynMC强化的高温大曲样本显示出与核心生产区的真菌群落结构高度相似。例如，A16和A31与仁怀样本RH3和RH4高度相关；A25和A34与金沙样本JSS高度一致；A15与泸州样本LZJ高度相似。LEfSe分析识别出了每个区域的独特真菌生物标志物，金沙样本中有10个生物标志物；泸州样本中有13个生物标志物；仁怀样本中有16个生物标志物。高温大曲样本的细菌组成也表现出明显的区域差异（图3C）。主要的属包括Kroppenstedtia、Thermoactinomyces、Bacillus、Saccharopolyspora、Virgibacillus、Unassigned_Bacillaceae、Scopulibacillus、Staphylococcus、Weissella和Pseudonocardiaceae。这些细菌共同占据了高温大曲样本总微生物组成的75%以上。基于细菌群落的样本相关性分析揭示了更为复杂的聚类模式（图3D）。与真菌群落的相关性矩阵（图3B）相比，细菌群落显示出更复杂和多样化的分组，表明细菌群落在结构上更为复杂，可能具有更强的区域特异性。本研究中，SynMC强化的高温大曲样本与核心生产区的细菌谱表现出强烈的一致性（图3D）。

图3. 高温大曲样本的微生物群落分析。（A）堆叠条形图显示来自不同区域的高温大曲样本的真菌组成，Thermomyes和Thermoascus在各个区域的真菌群落中占主导地位。（B）真菌群落的聚类分析，显示来自不同区域的样本之间的显著聚类模式。（C）堆叠条形图显示高温大曲样本中的细菌组成。Kroppenstedtia、Bacillus和Thermoactinomyces是群落中占主导地位的细菌。（D）细菌群落的聚类分析显示不同区域的细菌群落之间复杂的聚类模式。

微生物群落代谢通路差异

基于昊为泰宏基因组绝对定量测序数据换算的相对定量结果，研究者对SynMC样本与核心生产区域样本之间的微生物代谢通路进行了分析，结果发现蛋白质功能主要与翻译、氨基酸代谢、转录、能量生产、碳水化合物代谢、脂质代谢和无机离子运输相关（图4A）。此外，碳水化合物活性酶数据库注释表明，酶的功能主要富集于多种碳水化合物结合模块和糖苷水解酶家族（图4B）。这些发现表明，HTD发酵过程中的微生物代谢通路具有区域特异性和功能保守性。细菌在氨基酸及其衍生物的代谢中起着核心作用，这可能是HTD风味特征形成的关键因素。

图4. 基于宏基因组绝对定量测序换算的相对定量大曲微生物群落代谢功能分析。(A)基于COG （Clusters of Orthologous Groups）同源蛋白数据库的功能标注。(B)基于CAZy（碳水化合物-活性酶）数据库的功能注释。（原文补充图5）

细菌代谢通路可视化及群落生物量对代谢能力的影响

利用MetaCyc数据库的层次分析揭示了高温大曲（HTD）中的十条主要细菌代谢通路。这些途径包括PWY-3781（有氧呼吸I（细胞色素c））、PWY0-1586（肽聚糖成熟（含美托二氨基庚酸））、PWY-7111（丙酮酸发酵为异丁醇）、PWY-7094（脂肪酸回收）、PWY-5101（L-异亮氨酸生物合成II）、ILEUSYN-PWY（L-异亮氨酸生物合成I（来自苏氨酸））、VALSYN-PWY（L-缬氨酸生物合成）、PWY-5667（CDP-二酰基甘油生物合成I）、PWY0-1319（CDP-二酰基甘油生物合成II）和PWY-6969（三羧酸循环V（2-酮戊二酸：铁氧还蛋白氧化还原酶））（图5A）。进一步分析与前四条途径相关的物种组成（图5B–E）揭示了一个主要贡献者集合，包括Kroppenstedtia、Saccharopolyspora、Thermoactinomyces、Pseudonocardiaceae、Bacillus、Virgibacillus、Unassigned_Bacillaceae、Staphylococcus、Streptomyces、Oceanobacillus、Saccharomonospora和Scopulibacillus。这些类群与细菌组成分析中确认的主要类群高度重叠，表明HTD中的核心代谢功能主要由这些关键群落成员驱动。相同的主导物种反复出现在多个代谢通路中，表明它们在微生物群落中的多样化作用，既有助于功能复杂性，也有助于群落的适应性。

图5. 细菌代谢途径和代谢途径的微生物组成。(A)细菌代谢途径的堆积柱形图。(B) PWY-3781(有氧呼吸I(细胞色素C))、(C) PWY0-1586(肽聚糖成熟(含内消旋二氨基庚二酸))、(D) PWY-7111(丙酮酸发酵成异丁醇)和(E) PWY-7094(脂肪酸回收)代谢途径的细菌组成。

为了评估不同类群的贡献，以Kroppenstedtia的功能作为基准。通过将Kroppenstedtia的丰度作为参考，我们计算了相对于总相对丰度和Bacillus相对于Kroppenstedtia的丰度。在Kroppenstedtia主导的群落中，总丰度范围为1至1.2（图6A），而Bacillus相对丰度保持在0.6以下，在大多数样本中几乎接近零。相比之下，在Bacillus多菌株代谢群落中，总相对丰度超过12，Bacillus的功能相对丰度超过1.5（图6B）。Kroppenstedtia丰度的变化对整体代谢功能影响较小（图6C、6D）。相比之下，Bacillus丰度的增加显著改变了多个代谢通路的表达，使功能表型从Kroppenstedtia主导型转变为Bacillus多菌株状态。这一变化可能通过Bacillus介导的群体感应调控，强调其在HTD生态系统中的关键作用。虽然以往的研究表明，在复杂环境中的微生物群落往往通过功能冗余来维持稳定性，以适应变化的条件，但我们的结果表明，调节Bacillus丰度可以改变共存物种的功能贡献。Bacillus丰度的提高不仅改变了网络的结构属性，还使群落的相互作用从合作转变为竞争–合作混合互动状态。这一转变可能是大曲代谢特征形成的基础，从而为微生物干预提供了有前景的目标，以优化发酵过程。进一步的机制阐明需要使用多组学和系统生物学方法进行综合研究。

SynMC强化高温大曲与核心生产区域高温大曲细菌代谢通路的比较

细菌代谢通路的聚类热图分析（图6E）显示，除了RH2和RH6样本外，仁怀区域的样本（RH1、RH3、RH4、RH5、RH7）形成了一个明显的聚类。金沙非典型样本（JSAS: JSD、JSH、JSS、JSQ）也单独分组，而JSX样本则独立聚类。基于细菌代谢通路的相关性模式，HTD样本被分为四个代表性组：JSAS、RH（仁怀）、LZJ（泸州）和JSX。在SynMC强化样本中，A22与已定义的聚类有显著的分歧。这一分歧可能与A22中Byssochlamys和Acinetobacter的相对丰度较高有关，这可能影响了其代谢通路的特征。相比之下，其他SynMC样本则更清晰地与特定区域组的代谢特征一致。

相关性聚类热图显示，SynMC强化的高温大曲与某些核心生产区域的HTD样本之间具有显著的相似性（图6F）。具体来说，A12和A16与仁怀样本高度一致，因此被归类为ARH。同样，A11和A13与泸州样本显示出高度一致，因此被归类为ALZJ。此外，A25和A34与JSAS的一致性较高，被分类为AJSAS。后，A36和A35与JSX的一致性，被归类为AJSX。这些分组进一步通过代谢通路分析得到了支持。传统自然HTD的代谢通路LEfSe分析显示，来自三个核心区域的HTD样本中共识别出了204条差异代谢通路。其中，JSAS、RH、LZJ和JSX分别表现出了91条、17条、38条和58条差异代谢通路。在SynMC强化的高温大曲中，共检测到196条差异代谢通路，其中ARH有33条，ALZJ有77条，AJSAS有18条，AJSX有68条，这些与相应的自然样本高度相似。值得注意的是，这些组之间共享72条代谢通路，其中RH（ARH）、LZJ（ALZJ）、JSAS（AJSAS）和JSX（AJSX）分别共享8条、12条、12条和40条代谢通路。PCA和相关性分析的结果（图6E，6F）进一步确认了HTD组内的高相似性，差异主要集中在这72条代谢通路上（图7）。

图6. 细菌群落功能变化及其对代谢通路的影响。(A) Kroppenstedtia主导代谢功能型中，总微生物丰度与Bacillus丰度的核密度分布图。(B) Bacillus-多菌株代谢功能型的总丰度及 Bacillus 丰度的核密度分布图。(C)Kroppenstedtia主导代谢功能型内，微生物总丰度与主导代谢通路丰度的变化。(D) Bacillus-多菌株代谢功能型内，微生物总丰度与主导代谢通路丰度的变化。(E) 细菌代谢通路的主成分分析（PCA）。（F）样本相关性分析。

LDA 得分图直观展示了各区域组的核心通路差异，SynMC 与对应区域共享关键通路（如 PWY-7111显著富集）。SynMC与核心区HTD的特征细菌代谢通路LEfSe 分析鉴定出204条区域差异代谢通路（传统HTD）与196条差异通路（SynMC HTD），其中72条通路为共享核心通路。

图7. SynMC样品和核心区样品的特征性细菌代谢通路。这些通路由线性判别分析效应大小(LEfSe)表示(LDA > 2，p < 0.05)。

本研究通过微生物扩增子测序、宏基因组绝对定量测序及代谢组学等分析，揭示了SynMC与传统高温大曲中微生物群落在代谢通路和VOCs生成上的相似性与差异性。研究发现SynMC能够有效地复制传统高温大曲的理化特性、有机酸模式、微生物群落组成、代谢功能和挥发性有机化合物谱。热耐性真菌如Thermomyes、Thermoascus和Monascus占主导地位，而细菌群落则以Kroppenstedtia、Thermoactinomyces和Bacillus为主。在所有测量的指标中，理化性质表现出小的组间差异，有机酸谱表现出中等的分化，而VOCs谱则显示出大的变异性，表明VOCs是区分和分类高温大曲样本的有效指标。SynMC强化的高温大曲样本在VOCs谱上与传统样本高度相似，具有较高的相关系数。代谢通路分析揭示了SynMC强化的样本与传统样本之间72条共享的代谢路径，涵盖了氨基酸生物合成、碳代谢和能量生产，为理解SynMC如何复制复杂的代谢活动提供了机制性见解。该研究为通过SynMC技术优化高温大曲的稳定性提供了理论依据，有助于提高生产一致性，同时保留传统风味特征，为高温大曲生产的质量控制和工业化生产提供了新的视角和理论支持。

在本项研究中，宏基因组绝对定量技术发挥了重要作用，尤其是在精确测定微生物功能代谢通路方面展现出独特优势。传统的宏基因组技术通常依赖于相对定量，无法很好反映不同区域微生物群落的变化情况。而宏基因组绝对定量技术能够提供消除这些变量的干扰，有利于更好揭示微生物与代谢产物之间的重要关联,为理解食品发酵过程中微生物的群落演替、代谢通路及其与风味物质关系提供了更为全面和精准的数据支撑。