近日，上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科李青峰、谢峰团队及澳门科技大学医学院张康团队合作在国际著名期刊Signal Transduction and Targeted Therapy（IF：52.7）发表新研究成果“Anti-BCL2 therapy eliminates giant congenital melanocytic nevus by senolytic and immune induction”，发现抗BCL2治疗能够通过衰老细胞清除和免疫诱导消除先天性巨大黑痣，为GCMN患者治疗迎来新的曙光！团队成员魏伯轩博士、余庆雄博士为共同一作。值得一提的是，昊为泰参与了本研究中的转录组测序及分析工作。

1.BCL2表达及GCMN细胞生存

BCL2 表达有助于P16+衰老型和Ki67+增殖型先天性巨大黑痣（GCMN）细胞的长期存活。研究团队通过对50例GCMN患者进行免疫组化染色发现与细胞增殖相关的MAPK及PI3K-AKT通路被过度激活（图1c，e），衰老相关分泌表型（SASP）标志物免疫荧光染色进一步证实了GCMN细胞表现出广泛的衰老（图1d，f）。因此，确定在衰老和增殖的GCMN细胞中共同表达的靶点，可能有助于实现GCMN的完全消退。

对GCMN组织及相邻正常皮肤组织进行了RNA-seq测序，以筛选治疗靶点。凋亡通路是被显著富集且下调的通路，在凋亡和抗凋亡基因中，BCL2的表达显著上调（图1g），这表明其在GCMN中发挥着关键的抗凋亡作用。免疫组化及免疫荧光染色进一步证实了BCL2的表达是GCMN细胞的一个共同特征，并且可能解释了临床上所观察到的皮肤中GCMN细胞长期存在的现象。

图1 GCMN中检测到衰老和抗凋亡的特征

2.GCMN小鼠模型构建及BCL2抑制剂的疗效评估

团队利用Hipp11位点knock-in构建Nras^Q61K突变鼠，其表现出人GCMN的表型。继而用5种BCL2抑制剂分别检测对GCMN细胞的细胞毒性及相应表型，发现维奈克拉（venetoclax）靶向GCMN具有高度特异性。对维奈克拉处理的GCMN细胞进行转录组测序，发现凋亡通路显著上调（图2k），而且多种免疫反应被显著富集（图2l），这表明维奈克拉诱导了基于免疫的细胞毒性影响。因此，在体内研究维奈克拉治疗后的免疫反应是至关重要的。

图2 转录组测序揭示BCL2抑制剂诱导GCMN细胞凋亡及免疫反应

在体环境中，进一步实验也证实了维奈克拉有效靶向GCMN患者来源的异种移植模型小鼠体内的GCMN细胞，并诱导GCMN模型鼠的症状消退（图3）。

图3 BCL2抑制剂诱导显著痣消退

3.中性粒细胞介导消退GCMN病变中的免疫反应

免疫细胞的浸润凸显了免疫反应在增强BCL2抑制治疗效果方面所可能发挥的作用。单细胞RNA测序揭示了维奈克拉治疗后样本中中性粒细胞显著增加，而痣细胞显著下降（图4c，d）。未接受治疗的痣和正常皮肤中均未检测到中性粒细胞，但在接受维奈克拉治疗的痣中，中性粒细胞数量丰富，并且它们表达激活的中性粒细胞所特有的生物标志物（图4g）。中性粒细胞中细胞因子、白细胞介素以及NET途径的上调（图4h），表明这些机制参与了通过NETosis途径实现的痣细胞清除过程。

细胞通讯分析揭示了Il1b-Il1r1配体-受体相互作用对于中性粒细胞和凋亡的痣细胞间通讯至关重要，Il1b是在中性粒细胞top20基因中表达量高的白细胞介素（图4i）。

图4单细胞测序揭示了在维奈克拉治疗后的GCMN病变中存在由中性粒细胞引发的免疫反应

4.证实中性粒细胞参与痣消退

免疫荧光染色证实了IL1β+中性粒细胞和NET标志物出现在维奈克拉治疗的痣中（图5a，b），这一现象在GCMN消退的患者中（图5a，b）。后续在GCMN小鼠中分别注射不同免疫细胞的抗体，发现只有中性粒细胞的耗竭导致维奈克拉疗效的显著下降（图5c，d）。对黑色素含量（图5e，h）和Melan-A+痣细胞（图5f，i）的分析显示，在去中性粒细胞组中，黑色素含量显著更高，且约52%的Melan-A+痣细胞得以存活，这一比例高于其他去除免疫细胞的组。除了去中性粒细胞组外，其他所有组均观察到明显的中性粒细胞浸润（图5g，j）。

图5 中性粒细胞的耗竭以及IL1β的抑制会降低维奈克拉治疗GCMN的效果

本研究在GCMN中发现了主要的衰老细胞群和少量的增殖细胞群，这需要采用双靶向策略。结果发现，在具有不同基因突变的GCMN患者的衰老细胞和增殖细胞中，抗凋亡蛋白BCL2都有表达。P16和BCL2的共表达表明了生长停滞和细胞存活的表型。BCL2抑制剂（BCL2i）在体外对GCMN细胞显示出显著的细胞毒性。在患者来源的异种移植模型以及Nras^Q61K突变和Braf^V600E突变的转基因模型中，经过BCL2i处理后观察到了色素减退和GCMN细胞清除的现象。退化的GCMN组织学显示有广泛的免疫细胞浸润，表明存在免疫参与。单细胞测序和免疫染色显示，活化的中性粒细胞形成了细胞外陷阱，与BCL2i共同作用来治疗GCMN。中性粒细胞的清除和免疫抑制会降低治疗效果，这突显了BCL2i治疗后免疫反应的重要性。长期随访显示没有复发，中性粒细胞和T细胞存在于真皮层中，表明存在记忆性免疫反应。这些研究结果为治疗GCMN提供了一种有前景的疗法策略，并突显了BCL2i在该病症治疗中的转化应用潜力。