近日，中国科学院微生物研究所钟瑾研究员团队在国际著名期刊《International Journal of Biological Macromolecules》（IF=7.7，JCR: Q1）上发表研究论文。该研究利用昊为泰微生物Accu16S^®细菌绝对定量测序专利技术，联合蛋白质组学、代谢组学等多组学手段，系统揭示了植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）调控紫花苜蓿青贮蛋白转化的分子机制。研究强调了绝对定量测序在微生物与代谢产物关联分析中的关键作用，并为优化反刍动物氮素营养利用提供了理论依据。

英文题目：In-depth proteomic analysis of alfalfa silage inoculated with Lactiplantibacillus plantarum reveals protein transformation mechanisms and optimizes dietary nitrogen utilization

中文题目：植物乳植杆菌接种调控紫花苜蓿青贮蛋白质转化机制的蛋白质组学分析及其对膳食氮利用的优化作用

发表期刊：International Journal of Biological Macromolecules

影响因子：7.7（JCR: Q1）

发表时间：2025年5月

1、利用昊为泰Accu16S^®细菌绝对定量测序专利技术，首次量化了青贮过程中微生物绝对丰度变化与蛋白质转化之间的精确关联。

2、系统鉴定了青贮过程中介导蛋白降解的关键内生与微生物源蛋白酶，明确了三肽酶与羧肽酶的主导作用。

3、阐明了L. plantarum接种通过提高肽氮水平、减少氨氮损失，实现蛋白保留与高效转化。

4、鉴定出多种具有潜在生物活性的功能肽，如Ile-Pro、Pro-Val、Trp-Phe等，揭示青贮饲料的功能营养潜力。

5、明确蛋白亚细胞定位与分子量特征对其在青贮过程中降解敏感性的决定性影响。

1、L. plantarum 显著改善青贮发酵品质与营养保留

研究者首先分析了苜蓿青贮的基础发酵参数。通过比较新鲜苜蓿组（FR）、用灭菌水青贮处理组（CK）、接种具有胞外蛋白酶PrtR的L. plantarum NF92组（LN）、接种不具胞外蛋白酶的L. plantarum B90组（LB）。结果显示，无论是否具备胞外蛋白酶PrtR活性，接种植物乳杆菌NF92（LN组）和B90（LB组）均显著降低pH值（分别为4.18和4.22），提升乳酸含量，抑制干物质损失（图1A-D）。此外，LB组的乳酸/乙酸比值更高，表明发酵效率更优。LN组有效降低了ADF与NDF含量，提示其在改善纤维可消化性方面可能更具潜力。

图1. 紫花苜蓿青贮的发酵与营养品质特征。A，新鲜样品（FR）及青贮处理组（CK, LN, LB）的pH值。B，各组青贮饲料中的乳酸（lactic acid）含量。C，各组青贮饲料中的乙酸（acetic acid）含量。D，青贮样品中乳酸与乙酸的比例（LA/AA）。E，新鲜样品与青贮样品的干物质（dry matter, DM）含量。F，青贮过程中干物质损失（DM loss）。G，样品中水溶性碳水化合物（water-soluble carbohydrates, WSC）含量。H，酸性洗涤纤维（acid detergent fiber, ADF）含量。I，中性洗涤纤维（neutral detergent fiber, NDF）含量。FR：新鲜苜蓿；CK：用灭菌水青贮处理；LN：接种具有胞外蛋白酶PrtR的L. plantarum NF92；LB：接种不具胞外蛋白酶的L. plantarum B90。

2、蛋白亚组分变化揭示降解路径转化

进一步通过CNCPS系统对蛋白亚组分进行分析。研究发现，LN与LB组显著提高了真蛋白PB1比例（图2C），而氨氮（NH3-N）和游离氨基酸氮（AA-N）水平则显著下降（图2F-G），同时肽氮（peptide-N）显著升高（图2H）。表明L. plantarum通过抑制脱氨作用，推动蛋白水解向保留肽的方向转化。

图2. 紫花苜蓿青贮蛋白组分构成与氮素形态分析（基于CNCPS系统）。A，粗蛋白（crude protein, CP）含量；B，可溶性蛋白（soluble protein, PA2）含量；C，瘤胃可降解真蛋白（rumen degradable true protein, PB1）含量；D，瘤胃不可降解真蛋白（rumen undegradable true protein, PB2）含量；E，不可消化蛋白（undigestible protein, PC）含量；F，氨氮（ammonia nitrogen, NH₃-N）含量；G，氨基酸氮（amino acid nitrogen, AA-N）含量；H，肽氮（peptides nitrogen, peptide-N）含量。

3、蛋白质组揭示关键蛋白变化模式

蛋白质电泳及TMT标记质谱结果揭示，青贮导致大分子量蛋白（如RuBisCO）显著降解，同时小分子蛋白如三肽酶、羧肽酶等显著上调（图3A-D）。蛋白质PCA分析区分了处理组间蛋白组成差异（图3B）。LN与LB组相较于CK组进一步促进了35–45 kDa范围内蛋白的表达（图3E-G），说明这些处理通过特定蛋白群的调节作用改善了蛋白转化路径。

图3. 紫花苜蓿青贮蛋白质组的深入特征分析。A，各处理组蛋白丰度与分子量变化的总览；B，不同处理组的主成分分析（PCA）；C，FR组45–55 kDa蛋白网络图，每个节点代表一个蛋白，以比例标注相对丰度，黄色区域为RuBisCO大亚基蛋白；D，CK组55–70 kDa蛋白网络图，绿色边缘表示蛋白酶活性，颜色代表表达变化倍数；E，各组前10位丰度蛋白的累积分布曲线；F，各组蛋白总丰度定量分析；G-I，火山图显示CK vs FR、LN vs CK、LB vs CK间差异表达蛋白（DEPs）数量（p < 0.05，fold change ≥ 2）；J，各处理组调控蛋白的总丰度比较。

4、差异表达蛋白的分子量与特异性特征揭示蛋白转化路径

为了进一步识别各处理间差异表达蛋白（DEPs）的特异性，研究者构建了Venn图比较CK vs FR、LN vs CK以及LB vs CK三组对比下的上调与下调蛋白分布情况。结果显示，CK组与FR组间存在数量多的特异性差异蛋白，说明青贮处理本身对蛋白组成具有显著改造效应；而LN与LB组之间高度重叠，仅有少量差异，提示这两种L. plantarum菌株在蛋白转化机制上的差异较小（图4A、4B）。进一步对DEPs的分子量与丰度结构进行分析发现，在CK vs FR组中，45–55 kDa蛋白占比高（48.84%），其中有45.89%的蛋白呈现下调，说明RuBisCO等大分子蛋白为主要降解对象（图4C、4F）。而在LN vs CK和LB vs CK组中，35–45 kDa范围内的蛋白数量和丰度显著增加（图4D、4E、4G），表明L. plantarum接种促使蛋白降解由大分子结构向中小分子过渡，并可能富集功能肽或小分子蛋白。这种分子量结构的重塑暗示了微生物接种不仅调节蛋白降解速率，还可能影响降解产物的营养与生物功能特性。

图4. 紫花苜蓿青贮不同处理组间蛋白质组成特征差异。A，不同处理间共有与特有下调蛋白数量；B，不同处理间共有与特有上调蛋白数量；C，CK vs FR组调控蛋白的丰度与分子量分布总结；D，LN vs CK组调控蛋白分布；E，LB vs CK组调控蛋白分布；F，CK vs FR调控蛋白的数量网络图，绿色节点表示蛋白分子量，颜色表示上/下调，大小表示fold change；G，LN vs CK 和 LB vs CK 调控蛋白的数量网络图，边缘颜色表示是否为共同调控。每个节点均为注释蛋白的UniProt编号。

5、亚细胞定位揭示蛋白降解敏感结构

研究者进一步探讨了蛋白在细胞内部空间结构中的分布特征，以明确不同亚细胞定位对蛋白稳定性的影响。蛋白亚细胞注释结果显示，膜蛋白、胞质蛋白和核糖体蛋白构成了青贮过程中蛋白组的主力成分，三者合计占总蛋白丰度的83%以上（图5A-B）。与FR组相比，CK组中核糖体与胞质蛋白显著下调，而膜蛋白中部分水解相关蛋白上调，提示膜结构破坏可能增强了降解酶接触底物的机会（图5C-D、5G）。LN与LB处理进一步加剧了胞质蛋白的降解，其丰度下降达到70%以上（图5E-F、5H-I）。这表明L. plantarum的接种不仅介导胞外环境的发酵改变，还可能通过渗透作用或代谢产物改变细胞膜通透性，从而间接促使细胞内容物暴露于蛋白酶的作用之下，推动蛋白全面降解。

图5. 亚细胞蛋白组的定量分析。A，蛋白在不同亚细胞结构中的分布概览；B，总蛋白在各亚细胞结构中的丰度及比例，膜蛋白、胞质蛋白和核糖体蛋白为主；C，CK vs FR组上调蛋白的亚细胞定位比例；D，CK vs FR组下调蛋白的亚细胞定位比例；E，LN vs CK组下调蛋白定位分布；F，LB vs CK组下调蛋白定位分布；G，CK vs FR组中各亚细胞结构的调控蛋白相对丰度；H、I，LB vs CK 与 LN vs CK中不同亚细胞蛋白丰度对比。

6、功能注释分析揭示蛋白酶主导的蛋白转化机制

通过GO注释分析，研究者揭示了蛋白表达变化背后的功能机制。在CK vs FR组中，下调蛋白富集于细胞过程、代谢与生物合成路径，而上调蛋白则主要集中在水解酶活性、肽酶活性及蛋白水解等生物过程（图6A-C），反映了青贮过程中蛋白转化活动的显著增强。进一步的功能网络分析表明，CK组中上调的蛋白酶主要包括三肽酶、羧肽酶、丝氨酸蛋白酶等，它们协同介导蛋白逐级降解为小肽与氨基酸（图6D-E）。在LN与LB处理中，这些蛋白酶活性路径被明显下调（图6F-I），形成与CK组相反的调控趋势。这种“去活性化”调控可能是接种L. plantarum所诱导的一种保护机制，限制肽类物质进一步降解为游离氨基酸与氨，从而减少氮素损失、促进有益肽的保留。

图6. 差异蛋白的功能注释分析。A，总体DEPs的GO功能注释（分子功能、细胞组分、生物过程）；B，CK vs FR组下调过程前30个富集条目；C，CK vs FR组上调过程前30个富集条目；D，CK vs FR组中上调蛋白酶活性类别的富集；E，CK vs FR组中具有蛋白水解活性的上调蛋白网络图；F，LB vs CK组下调GO术语前30项；G，LB vs CK组蛋白酶活性相关下调蛋白网络图；H，LN vs CK组下调GO前30项；I，LN vs CK组蛋白酶活性相关下调蛋白网络图。

7、功能性小肽与关键氨基酸积累揭示潜在营养提升

为探索青贮产物中潜在的功能肽营养价值，研究者开展了小肽代谢组分析，识别出58种小肽，其中以二肽为主，Ile-Pro、Pro-Val等为富集的构成（图7A-B）。基于PeptideRanker和BIOPEP数据库预测，共有25条小肽具备较强的生物活性，表现出DPP-IV抑制、ACE抑制和抗氧化等多重功能（图7C），提示青贮产物除饲料功能外，具备一定的保健潜力。在氨基酸层面，LN与LB组在保持整体氨基酸总量上升的同时，使Glu和Arg等关键功能氨基酸显著富集（图7D-E）。Glu有助于提升鲜味与适口性，而Arg则能促进乳蛋白合成，这表明通过L. plantarum接种可提升青贮产品的营养利用价值与生理调节潜能。

图7. 小肽组成与氨基酸含量揭示蛋白降解特征。A，不同组样品中小肽（di-/tripeptides）组成及相对丰度统计；B，前20位丰度高的小肽及显著差异；C，小肽的生物活性网络图（DPP-IV抑制、ACE抑制、抗氧化等），颜色表示PeptideRanker预测得分；D，20种标准氨基酸在各处理组的相对丰度，n=5；E，各组氨基酸之间的显著性差异。

8、16S绝对定量测序揭示L. plantarum主导微生物生态重塑

为解析L. plantarum如何在微生物层面影响蛋白转化，研究者采用昊为泰Accu16S^®细菌绝对定量测序专利技术（V3-V4区）对各组菌群结构进行了高分辨率绝对定量分析。PCA结果显示，FR、CK与接种组在群落结构上显著分化，LN与LB组中多样性指数显著下降（图8A-B），提示菌群被快速优势化。L. plantarum在接种组中成为绝对主导种，其拷贝数高达10⁷级别，占比超95%，同时抑制了E. mundtii、Bacillus等非目标菌的增殖（图8C-E）。微生物功能基因预测显示，CK组富集多种蛋白水解酶基因，而LN与LB组中多数蛋白酶相关基因表达量显著下调，仅Pip等少数基因例外（图8F-H）。这些结果表明，L. plantarum通过菌群重构与代谢调控，间接降低了无序蛋白水解活性，有效实现蛋白氮的“精准释放”。

图8. 微生物群落结构变化与蛋白代谢相关性分析。A，不同处理组的微生物群落PCA分析；B，各组OTUs数量、Chao1、ACE及Shannon指数显示物种多样性变化；C，各组主要菌种的相对与绝对丰度（16S绝对定量）；D、E，LEfSe分析L. plantarum为LN、LB组中富集的关键种；F，基于PICRUSt预测的蛋白水解酶基因热图展示；G、H，STAMP分析显示LN与LB组中蛋白水解酶基因显著减少。

9、微生物–代谢物关联揭示L. plantarum调控网络核心地位

为明确微生物与蛋白降解产物之间的直接关联，研究者构建了菌–代谢物的相关性网络。Spearman分析显示，L. plantarum丰度与多种功能肽（如Val-Ile-Arg、Pro-Val）、乳酸、PB1蛋白及peptide-N呈显著正相关（r > 0.8），而与AA-N、NH₃-N、DM损失呈强负相关（图9A-B）。其在蛋白水解酶基因层面也呈负调控关系，进一步说明其对氮损失路径具有抑制作用（图9C）。RDA分析与circos圈图显示L. plantarum在调控蛋白组分、营养指标、小肽形成与关键酶表达方面，均占据生态网络的中心地位（图9D-H）。这一发现强调了L. plantarum不仅是“发酵促进剂”，更是“蛋白转化优化者”，为未来定向构建功能性微生物制剂提供了理论基础。

图9. 微生物与发酵产物、蛋白降解指标之间的相关性。A，L. plantarum、E. mundtii、Bacillus sp.、W. paramesenteroides与发酵指标、营养指标和氨基酸的Spearman相关热图；B，上述菌种与功能小肽之间的相关热图；C，菌种与蛋白水解酶功能基因之间的相关性热图；D、E，L. plantarum与发酵性状、蛋白组分之间的冗余分析（RDA）；F、G、H，氨基酸、小肽及蛋白酶基因与L. plantarum之间的circos关联图。

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