近年来，高寒草甸生态系统植物-微生物互作机制研究成为生态学研究的热点。高寒草甸由于其独特的气候和土壤条件，使得植物根系微生物群落在生态系统功能中扮演着至关重要的角色。然而，目前大多数研究主要依赖相对定量测序方法，仅能揭示微生物群落组成的相对比例，难以准确反映各微生物实际丰度的变化。尤其是在植物根系相关真菌群落的研究中，由于不同宿主植物根系结构和生理状态存在较大差异，相对定量方法往往低估了不同植物间真菌群落丰度的真实差异。因此，如何准确测定微生物的绝对丰度成为亟待解决的科学问题，对揭示植物-根系相关真菌互作机制具有重要意义。

近日，来自兰州大学草种创新与草地农业生态系统全国重点实验室的研究团队，在国际二区期刊European Journal of Soil Science上发表了题为Quantitative Microbiome Profiling Facilitates Convenient Detection of Root‐Associated Fungi in an Alpine Meadow的研究论文。该研究利用昊为泰微生物AccuITS^TM真菌绝对定量测序技术（ITS3/ ITS4区段），对青藏高原20种高寒草甸植物根系相关真菌群落进行了高通量绝对定量（QMP）分析，并与传统相对定量测序（RMP）分析进行了对比。值得注意的是，根系相关真菌的微生物负荷因寄主植物而异；QMP方法与RMP方法在植物种间主要真菌属的分布模式不一致，RMP方法低估了不同宿主间根系相关真菌群落的差异。基于这些发现，本文得出结论：绝对定量微生物组分析有助于更好地了解植物根系相关真菌动力学及其生态和功能过程。该成果不仅弥补了传统相对定量方法在评估微生物丰度上的不足，同时为深入理解高寒草甸生态系统植物-根系相关真菌互作机制提供了新的理论依据。

【中文题目】：微生物组绝对定量分析有助于高效检测高寒草甸根系相关真菌

【发表时间】：2025年1月30日

 研究方法 

在实验设计上，研究者于2022年8月28日，在 30×30 m²平坦草甸样地采集20种植物。为减少生长状态差异对真菌群落的影响，每种植物选取三株高度及冠幅相似的个体作为样本。样本采集后，研究者对植物根部进行仔细清洗以去除表面杂质，并迅速冷冻保存，以确保后续DNA提取过程中样品质量的稳定。随后，利用DNA提取试剂盒对每份根样本进行总DNA提取，提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳检测后，通过昊为泰微生物AccuITS^TM真菌绝对定量测序对ITS3/ ITS4区段进行测序。

在数据处理环节中，研究者对原始测序数据通过QIIME 2插件进行去重和质控，并利用DADA2进行序列去噪，从而获得高精度的扩增子序列变异（ASVs）。随后，针对每一样本，通过构建总reads数与加入内标拷贝数的标准曲线，计算各ASV的绝对拷贝数。为了保证数据分析的严谨性，剔除了所有非真菌ASVs和reads小于6的ASVs。使用抽平后的相对定量数据评估真菌群落组成，未抽平数据用于α-多样性分析以消除测序深度差异的影响；绝对定量数据不抽平进行分析，以便更真实地反映微生物的实际丰度。

 结果 

在过滤掉低质量、短和模糊的序列后，QMP与RMP共得到4285个真菌ASVs。值得注意的是，测序方法对真菌丰富度无显著影响。不同植物物种间根系相关真菌的绝对丰度存在显著差异。在检测样本中，垂穗披碱草（Elymus. nutans）的绝对丰度高，达到376,208,487个reads，而甘肃棘豆（Oxytropis kansuensis）的绝对丰度低，仅为1,668,347个reads，约为垂穗披碱草丰度的1/225。这一显著对比凸显了不同植物物种间真菌绝对丰度的巨大差异。

在门（子囊菌门）和功能群（腐生真菌）水平上，QMP与RMP分析均显示相似的优势类群分布趋势。然而，两种测序方法揭示了宿主植物间优势真菌属存在显著差异：绝对丰度前三的真菌属分别为Sporothrix（7.50%）、Fusarium（6.08%）和Cistella（3.05%）；而相对丰度前三的真菌属则为Tetracladium（5.31%）、Paraphoma（3.71%）和Didymella（3.45%）。此外，QMP与RMP揭示了优势属在不同植物间的不同分布模式（见图1）。例如，利用QMP方法，Acrospermum在花苜蓿（Medicago ruthenica，5.56%）与唐松草（Thalictrum aquilegiifolium，4.84%）中占主导地位，但利用RMP方法时，该属仅在花苜蓿中占主导地位（7.97%）；在QMP分析中，Didymella在唐松草中丰度排名第七（1.28%），但在RMP中排名第一（6.10%）。

图1 不同植物物种根系相关真菌优势属的绝对丰度和相对丰度

图中圆点大小分别表示绝对丰度（以log₃为底）和相对丰度，直观展示了各优势真菌属在不同宿主植物中的分布情况。

主坐标分析（PCoA）和置换多元方差分析（PERMANOVA）表明，宿主植物身份对QMP和RMP方法检测的根系相关真菌群落组成均具有显著影响。Bray-Curtis相异性分析显示，在半数植物中基于QMP获得的根系相关真菌群落相异性显著高于RMP的。植物系统发育距离与根系相关真菌Bray-Curtis相异性在QMP与RMP中均呈显著相关性，但RMP低估了不同宿主植物间根系相关真菌群落的差异性，并且回归斜率更大（图2）。

图2 利用昊为泰微生物AccuITS^TM真菌绝对定量测序方法得到的绝对定量

（QMP）和相对定量（RMP）的植物系统发育距离与根系相关真菌Bray-Curtis相异性的回归分析。图中展示了在两种测序方法下，不同植物间系统发育距离与真菌群落差异的回归分析及其斜率比较，揭示了QMP在反映宿主植物间微生物群落差异方面的优势。

 讨论 

本研究比较了高寒草甸20种植物根系相关真菌群落的相对与绝对丰度特征。尽管两种方法检测的真菌丰富度相近，但两者揭示优势真菌属的分布模式存在显著差异。

根系相关真菌的绝对丰度在不同植物间差异很大，绝对丰度高的植物（垂穗披碱草）的reads比绝对丰度低的植物（甘肃棘豆）高出约100倍。然而，这种差异与植物系统发育无关，表明即使是亲缘关系较近的植物，其根系相关真菌丰度也可能存在显著差异。有研究表明，植物根系构型及次生代谢产物可能通过调控根际微环境驱动植物-真菌互作，例如直根系植物可能更依赖真菌共生。另一个重要的技术问题是，DNA提取物中存在大量植物DNA可能会影响真菌DNA的扩增。因此，采用更具真菌特异性的引物对准确表征高寒草甸生态系统中根系相关真菌的定量组成至关重要。

本研究中，利用绝对定量与相对定量微生物组剖析方法所揭示的微生物丰度模式存在明显差异，这与先前研究结果一致，表明RMP方法低估了高寒草甸宿主植物间根系相关真菌群落的异质性。这种差异可能源于两种方法对测序数据处理流程的不同：RMP数据在分析前需先进行抽平以统一测序深度，但该步骤可能导致信息丢失，尤其在测序深度差异显著或部分分类群高度丰度而其他分类群稀有的情况下；而QMP直接测量微生物分类群的绝对丰度，并规避了测序深度偏差，确保微生物群落组成不受技术因素的影响。当在气候变化胁迫实验（如干旱、高温、盐胁迫）中，比对受胁迫样本与对照样本时，土壤生态系统中微生物生物量的差异可能非常显著，此时直接测量尤为重要。例如，若在胁迫条件下所有根系相关真菌在胁迫下绝对丰度呈比例增加，RMP的相对丰度数据将无法捕捉此类响应，只有通过QMP方法才能检测到其响应变化。因此，QMP方法为微生物群落动态研究提供了更为可靠与可重复的表征。

 研究结论 

综上所述，本研究利用昊为泰AccuITS^TM真菌绝对定量测序技术，对青藏高原高寒草甸中20种植物根系相关真菌群落的相对丰度和绝对丰度进行了全面检测和系统对比。本研究揭示了绝对定量与相对定量方法在植物根系相关真菌丰度模式上的显著差异。不同宿主植物间根系相关真菌绝对丰度存在巨大差异，相对定量方法在反映群落相异性方面存在局限性，而绝对定量技术能够真实呈现微生物的动态变化。

研究者认为，绝对定量测序技术因其能够精准量化微生物丰度的优势，更能反映实际微生物丰度，因而更适用于揭示微生物过程、相互作用及其生态功能。该技术为深入探讨高寒草甸生态系统植物-根系相关真菌互作提供了重要工具，对未来类似生态系统及微生物群落研究具有广泛的应用前景。

 昊为泰Accu16S^®细菌与AccuITS^TM真菌绝对定量测序专利技术 

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