昊为泰AccuFL^TM三代全长扩增子绝对定量测序是在常规三代全长扩增子测序的基础上，增加了检测全长基因的绝对拷贝数。具体方法是通过向样品DNA中添加一系列人工合成内标序列，在同一体系中进行检测全长基因的文库构建，上机测序。测序数据中的内标序列数据通过生信方法提取，并根据其对应的绝对拷贝数进行标准曲线绘制。通过标准曲线可以计算获得各样本中检测全长基因的绝对拷贝数，从而实现在绝对拷贝数水平对样本中的全长基因丰度进行检测。此外，通过常规三代全长扩增子生信分析流程，可以同时获得相对定量测序，并且通过相对定量-绝对定量数据比较得到联合分析结果，更加全面准确地反映样本中微生物群落多样性信息。

技术优势：

1、显著提升“种水平”鉴定分辨率：采用PacBio SMRT长读长测序平台开发，可全面覆盖16S rRNA基因V1-V9区全长，获得的物种注释信息及群落结构结果更加准确，显著提升“种水平”的鉴定效果，改进二代扩增子数据的解析深度和准确性，为后续重要微生物的菌种筛选和功能性验证实验提供了坚实的基础。

2、绝对定量+相对定量同时获得：引入内标序列，构建标准曲线，通过绝对拷贝数计算提供微生物群落的绝对定量和相对定量数据，使研究者能够全面了解微生物的真实丰度和多样性。

3、减小引物偏差：使用基因全长引物，从而避免了二代测序不同区段引物的扩增偏差，使结果更加准确。

提高数据可比性：采用加入人工内标的绝对定量技术，可以确保不同实验批次检测结果的可比性，解决了由实验方法、批次差异等因素引起的技术误差，从而获得更加真实可信的比较结果。

4、技术方法成熟：该方法是在成熟的昊为泰Accu16S^®细菌绝对定量测序专利技术基础上开发的。Accu16S^®细菌绝对定量测序推出的六年多来，检测项目1300多项，发表SCI文章近百篇，这些都为AccuFL^TM三代全长扩增子绝对定量测序技术服务打下了坚实的基础。

样品类型：主要针对土壤、土壤、水体、口腔拭子及DNA样本进行检测，其他样本类型需评估

样品需求量：由于环境的样本DNA比较特殊，DNA的总量不能代表有效的模板量，质控以能有效扩增目标区域为准。样本纯度为完整无污染的基因组DNA

送样方式：DNA样本溶解于水或TE，每个离心管用parafilm膜密封，样品需-20℃保存，冰袋运输，保证运输途中冰袋不会完全融化；土壤、粪便等样本采集后，每个离心管用parafilm膜密封，样品需-80℃保存，干冰运输，保证运输途中干冰不会完全融化

质控合格的样本，DNA与内标序列一起进行目标区域PCR扩增，产物进行绝对定量文库构建。测序采用PacBio进行三代CCS模式进行，测序数据量为10万HiFi reads。

AccuFL^TM三代全长扩增子绝对定量测序实验及分析流程图

1、昊为泰AccuFL^TM三代全长扩增子绝对定量测序是基于什么平台开发的？

答：PacBio测序平台。

2、针对16S rRNA基因的测序引物是什么？

答：覆盖16S rRNA基因V1-V9区全长的27F和1492R引物。

3、昊为泰AccuFL^TM三代全长扩增子绝对定量测序测序数据量多少？

答：10万 HiFi reads。