天昊AccuMetaG®宏基因组绝对定量测序在常规的宏基因组测序基础上增加基因的绝对拷贝数检测。其方法是通过向样品宏DNA中添加一定量的已知拷贝数的内标序列，内标序列跟样本DNA在同一体系中同时进行宏基因组文库的构建，上机测序；测序数据中的内标序列数据被提取，联合内标序列的拷贝数，绘制标准曲线，用于计算样本中各基因的绝对拷贝数。

技术路线：

技术优势：

该方法可以同时获得宏基因组绝对定量结果和常规宏基因组相对定量结果，根据需要还可以给出联合对比分析结果。可同时获得样本中总菌的绝对定量、优势菌物种的绝对定量数据，通过基因绝对定量，获得差异功能基因分析结果，数据更加全面真实，更客观准确还原菌群结构、丰度数量、功能基因和功能通路分析。

•一次检测，可以同时提供绝对定量、相对定量结果，另外可以根据需要，给出联合对比分析数据，结果更丰富全面；

•通过内标方法，可规范不同的方法、实验和批次带来的差异，将真正的生物学差异与混杂因素加以区分，结果更加真实准确；

•检测通量高，可以获得样本总菌和各分类群的绝对定量结果；可以同时获得细菌、古菌、真菌和病毒的绝对定量结果。

•与常规的相对定量宏基因组一样，获得比扩增子测序更高的菌种水平分辨率；

•通过利用多个数据库，获得包括如碳、氮、磷、硫循环，以及抗性基因、毒力因子、碳水化合物酶类等相关功能基因等的绝对定量结果；

•相对定量和绝对定量数据相互印证，减少传统相对定量假阳性问题；

•避免qPCR等定量方法由于引物设计和优化问题导致的无法定量或者定量不准确问题；

•对样本的需求量要求低，避免因样本无备份等造成的无法检测情况。

总的来说，天昊AccuMetaG®宏基因组绝对定量测序专利技术在医学、环境、农学、食品以及生态学等多个领域都有广泛的应用前景，特别是对于那些需要深入挖掘功能基因和功能通路的微生物相关研究项目尤其适用。

样品类型：完整无污染、无降解的基因组DNA；

样品需求量：DNA≥1ug（满足2次建库实验）；

如需进行核酸抽提，样本需符合天昊生物所要求的样本类型、保存及送样条件，详见请咨询公司技术人员。

常规样本类型的收集、保存及运输方法如下：

A. DNA：溶解于水或TE，每个离心管用parafilm膜密封，样品需-20℃保存，冰袋运输，保证运输途中冰袋不会完全融化；

B. 土壤：样本采集后，至多每管2g分装；单次至多抽提0.5g；建议送样2g；每个离心管用parafilm膜密封，样品需-80℃保存，干冰运输，保证运输途中干冰不会完全融化；

采集方法：

a) 根据研究目的确定采样范围，取样器具要事先消毒灭菌处理；

b) 采样时应去除表面浮土，使用乙醇火烧的铲子挖取地下5~20cm的土层；

c) 去除可见杂质，土壤过2mm筛网；

d) 保存于无菌离心管中，至多2g分装，置于0℃以下运回实验室，尽快置于-80℃保存。

C. 水体：使用合适孔径滤膜过滤收集菌体，滤膜保存在离心管中，勿剪碎滤膜；单次抽提至多1张滤膜（5cm直径，200μm厚度）；建议送样2张滤膜；每个离心管用parafilm膜密封，样品需-80℃保存，干冰运输，保证运输途中干冰不会完全融化（如使用了超过1张滤膜过滤水体，需将所有滤膜送样并告知乙方）；

采集方法：

a) 根据研究目的确定采样深度和范围，采集好的水样需要通过滤膜进行过滤，可以根据水样的浑浊程度选择相应孔径的滤膜，液氮冻存后置于-80℃保存备用。

b) 清亮水样：可选择小孔径的滤膜，一般选0.22μm 或0.45μm 的滤膜，过滤水样体积大于10L。

c)  浑浊水样：过滤前静置分离悬浮颗粒，也可以用大孔径的滤膜预过滤一遍，再用小孔径的滤膜进行过滤。

注意事项：

使用多张滤膜过滤时，如存在滤膜间组分不均一的潜在可能，需送样全部滤膜，并告知公司沟通处理方案。

D. 粪便：样本采集后，至多每管2g分装；单次至多抽提0.5g；建议送样2g；每个离心管用parafilm膜密封，样品需-80℃保存，干冰运输，保证运输途中干冰不会完全融化；分析与结果；

人粪便采集方法：

收集新鲜粪便中段里部样品，同一样品可分装成小份（可每管收集分装 2 克），取样完毕后盖上盖子旋紧，若粪便样本量较多或不能马上收集，迟2小时内全部收集完毕，尽可能保持样品处于厌氧环境（如有条件可以使用厌氧袋）；将粪便样品迅速置于-80℃冰箱保存，每次取一小份进行提取，避免反复冻融。

小鼠粪便采集方法：

将待取样的小鼠放进干净的铺有消毒滤纸的笼子里，小鼠排便后立即收集粪便样本；不同的小鼠取样要更换新的滤纸；单个小鼠用灭菌离心管称取2g样本，分装好后立即放入-80℃保存。单个小鼠粪便样本不满足2g，可至少满足一次重提送样0.5g，或根据课题需求，将多个小鼠粪便样本混合为一个样品。

宏基因组绝对定量测序数据分析流程

1. Hardwick SA, Chen WY, Wong T, Kanakamedala BS, Deveson IW, Ongley SE, Santini NS, Marcellin E, Smith MA, Nielsen LK, Lovelock CE, Neilan BA, Mercer TR. Synthetic microbe communities provide internal reference standards for metagenome sequencing and analysis. Nat Commun. 2018 Aug 6;9(1):3096.

2. Crossette E, Gumm J, Langenfeld K, Raskin L, Duhaime M, Wigginton K. 2021. Metagenomic quantification of genes with internal standards. mBio 12:e03173-20.

1、宏基因组绝对定量测序数据的绝对定量计算如何进行？

答：测序文库构建时，样本DNA中添加适量的内标序列，一起进行文库构建、上机测序，测序完成后，提取出内标序列，进行绝对定量标准曲线制作。

2、宏基因组绝对定量测序适用于哪些样本类型？

答：与常规宏基因组相对定量测序检测一致，适用于土壤、水体滤膜、粪便等样本，其它特殊类型样本需要进行评估。