“昊创新、好技术！”
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微生物特定菌实时荧光定量PCR（qPCR）绝对定量是一种利用荧光定量PCR技术对微生物特定基因进行定量分析的方法。该方法利用引物和探针与目标DNA特异性结合，通过PCR扩增并荧光信号实时监测，从而实现对微生物特定基因数量的精确定量。qPCR通过检测荧光信号对PCR反应过程进行实时检测的技术。反应体系中的SYBR染料可以特异性地与新合成的双链DNA产物结合，释放荧光信号指征PCR扩增产物的累积，在扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，通过相对定量（与内参基因对比）或绝对定量（通过标准曲线对未知模板进行定量）的方法确定各个样本的本底表达量。
技术参数：
本技术是测定目的基因在样本中的分子数目，通过构建标准曲线对未知模板进行分子数目的定量，即通常所说的拷贝数。
样本类型及需求量：
完整无污染的基因组DNA，样本需求量：10ul（保证2次实验用量）（指至少0.5g样本进行抽提，50-70ul体积溶解的DNA原液）
土壤/植物等原始样本：样本需求量≥2g。
分析过程分为实验室操作和数据分析两部分。
实验室操作包括样品DNA提取、荧光PCR扩增、以及扩增后荧光信号的实时监测；
数据分析包括数据处理和结果解释。
1、微生物特定菌qPCR绝对定量能否检测到多个目标细菌？
答：可以。可以使用多个引物和探针同时进行扩增和检测，从而实现多个目标微生物同时检测。
2、qPCR有哪些注意事项？
答：避免污染：qPCR实验对样品的纯度和质量要求较高，需要避免DNA污染。实验室应建立RNA酶和DNA酶分离的区域，严格控制样品的取用和实验室操作。
引物和探针的设计：引物和探针的设计应选择特异性良好的序列，以避免与其他序列的杂交和干扰。
标准曲线的制备：标准曲线的制备应该充分考虑实验过程中的变异性，以确保结果的准确性。
数据解释：需要对实验结果进行科学解释，充分考虑实验设计、样品特点等因素。
3、qPCR与常规PCR有何不同？
答：qPCR是一种实时定量PCR技术，它通过实时检测PCR扩增过程中荧光信号的强度变化，实现对PCR产物数量的定量。而常规PCR则是通过PCR扩增后再进行检测。
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