宏基因组指特定环境中（如土壤，粪便等）全部生物（微生物）基因组的总和。顾名思义，宏基因组测序即对这种“混合”基因组进行高通量测序的实验技术。该技术能够实现微生物群体的基因组成及功能分析，微生物物种组成及丰度解读，微生物与环境或宿主间相互关系的探索，以及对新功能基因的挖掘与研究。相较于 16S/18S rDNA 和 ITS 测序，宏基因组测序在物种分类学研究中具有更高的分辨率的同时，更加侧重研究基因的功能。

肠道菌群对疾病的影响及宏基因组学国际项目

技术优势：

•宏基因组比微生物个体研究更能反映微生物生存的真实状态；

•宏基因组测序直接对环境中所有的微生物进行测序；

•使用高通量测序，能够获得低丰度物种的功能信息；

•构建不同物种之间协同的代谢网络。

样本类型：完整无污染的基因组DNA

样本浓度：浓度 ≥ 25 ng/μL

样本总量：总量 ≥ 2μg

分析流程包括：

数据预处理：对测序数据进行去除低质量序列、去除污染序列等预处理步骤，得到高质量的测序数据。

序列比对和组装：将高质量的测序数据进行序列比对和组装，得到微生物群落的宏基因组序列。

基因注释：对宏基因组序列进行基因注释，包括基因结构预测、基因功能注释等步骤。

群落结构分析：根据宏基因组序列中的16S rRNA、ITS等标记基因进行微生物群落结构分析，如物种多样性分析、群落结构差异分析等。

代谢通路分析：通过基因功能注释和代谢通路预测，分析微生物群落的代谢功能和代谢通路。

数据可视化和解释：对分析结果进行可视化和解释，如绘制热图、网络图等。

1、Feng P, Yang J, Zhao S, Ling Z, Han R, Wu Y, Salama ES, Kakade A, Khan A, Jin W, Zhang W, Jeon BH, Fan J, Liu M, Mamtimin T, Liu P, Li X. Human supplementation with Pediococcus acidilactici GR-1 decreases heavy metals levels through modifying the gut microbiota and metabolome. NPJ Biofilms Microbiomes. 2022 Aug 16;8(1):63. doi: 10.1038/s41522-022-00326-8. PMID: 35974020; PMCID: PMC9381558.

2、Tan X, Yang YL, Li X, Gao YX, Fan XY. Multi-metabolism regulation insights into nutrients removal performance with adding heterotrophic nitrification-aerobic denitrification bacteria in tidal flow constructed wetlands. Sci Total Environ. 2021 Nov 20;796:149023. doi: 10.1016/j.scitotenv.2021.149023. Epub 2021 Jul 14. PMID: 34280639.

1. 宏基因组与16S测序研究的侧重点有什么不同？

答：16S 研究物种丰度、 物种组成和差异物种。宏基因组还可以进行基因和功能的注释及分析，还可以看到特定代谢通路内部基因调控的酶的变化，从而研究微生物、 环境和宿主之间的关系。

2.宏基因组与16S测序物种注释有什么区别？

答：16S物种注释基于OTU的代表序列，与RDP、SLIVA或Greengenes数据库进行比对。

宏基因组物种注释基于 Clean Reads，与NCBI RefSeq数据库中已知的细菌、真菌、病毒和古细菌序列进行比对。

3.16S鉴定出的物种与宏基因组鉴定出的物种哪个多？

答：用同样的样品分别进行宏基因组和16S测序分析，16S在门、纲、目、科、属水平注释上的物种均多于宏基因组，这是因为16S测序深度深，可以检测到低丰度的菌群，菌群的信息量大。而宏基因组仅在种水平注释上的物种组成显著多于16S。

4. 16S的OTU与宏基因组的基因的作用区别？

答：16S基于OTU丰度表，进行物种Alpha多样性、Beta多样性、群落组成、组间差异菌群等分析。

宏基因组基于基因丰度表，进行差异基因分析，CAG分析及MGS聚类分析、功能注释和差异功能通路等分析。

5. 宏基因组测序功能注释分析所用数据库一般有哪些？

答：一般包括eggNOG数据库、基于CAZy 碳水化合物活性酶数据库、基于ARDB耐药基因数据库功能注释分析、KEGG分析和基于VFDB毒力因子数据库等。

6. 对于生物学重复偏离较大的样本，如何进行分析？

答：生物学重复通常建议5个以上，至少3个。对于出现显著离群的个别样本，推测可能为样本自身的原因（如在采样、保藏、提取、扩增过程中样本出现了问题等），建议剔除该样本后，再进行分析。

7. 宏基因组测序数据量多少合适？

答：受到测序深度及测序成本的影响，在现在的宏基因组文章中，根据样本类型等情况，如人类肠道一般选择6 Gb，就可以测出样品中绝大多数的微生物。对于复杂的样本，如土壤等，以及关注一些低丰度的物种，则需要加大测序深度。

8. 微生物宏基因组测序可以应用于哪些研究领域？

答：微生物宏基因组测序可以应用于多个研究领域，包括环境微生物学、人体微生物组研究、农业微生物组学等。在环境微生物学中，微生物宏基因组测序可以用于研究不同环境中微生物群落的组成和功能，探索微生物与环境的相互作用机制。在人体微生物组研究中，微生物宏基因组测序可以用于研究人体微生物群落的组成和功能，探索微生物与人体健康的关系。在农业微生物组学中，微生物宏基因组测序可以用于研究微生物在农业生产中的功能和应用，如农业土壤微生物多样性和农产品微生物质量安全等。