天昊生物自主研发的创新技术--AccuITS™真菌绝对定量测序，是通过向样品DNA中添加人工合成的不同拷贝数的spike-in 内标序列，之后进行ITS扩增子文库构建、测序，再根据spike-in 内标的ITS扩增子reads数及其绝对拷贝数绘制出标准曲线，后就成功获得样品中OTU代表序列对应的真菌物种绝对拷贝数。

所以简单的说相对定量是由测序reads得到OTU，然后经过抽平后再进行生信分析。而绝对定量是在获得测序reads，得到OTU后，不抽平，而是直接利用标准曲线换算成绝对拷贝数后进行分析。

试验及分析流程

技术优势：

   • 一次检测，三套数据，结果更丰富；

   • 对样本的需求量要求低，避免因样本无备份等造成的无法检测情况；

   • 检测通量高，检测合格范围内各类菌种均可绝对定量；

   • 相对定量和绝对定量数据相互印证，减少传统相对定量假阳性问题；

   • 避免跨平台qPCR定量的系统误差；

   • 避免因样本DNA抽提等原因造成的PCR抑制剂残留对结果准确性的影响；

   • 避免qPCR等定量实验碰到的引物设计和优化难题。

样本类型：DNA、土壤、粪便或其他环境样本

DNA需求量：浓度 ≥ 20ng/μL，总量 ≥500 ng （一个片段，两次实验需求量）

样本完整度：琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA完整性，要求电泳条带清晰可见，无明显降解，且无RNA污染

AccuITS^TM真菌绝对定量测序技术的数据分析包括：序列质量控制、序列比对和OTU聚类、物种注释、标准曲线构建、样本绝对丰度计算和分析等步骤。分析结果包括各菌群不同分类水平的绝对丰度、相对丰度和联合分析等内容。

功能预测（PICRUSt2）

物种与环境因子相关性分析

1． Kang J, Chen X, Han BZ, Xue Y. Insights into the bacterial, fungal, and phage communities and volatile profiles in different types of Daqu. Food Res Int. 2022 Aug;158:111488. doi: 10.1016/j.foodres.2022.111488. Epub 2022 Jun 7. PMID: 35840201.

2． Yang Y, Qiu K, Xie Y, Li X, Zhang S, Liu W, Huang Y, Cui L, Wang S, Bao P. Geographical, climatic, and soil factors control the altitudinal pattern of rhizosphere microbial diversity and its driving effect on root zone soil multifunctionality in mountain ecosystems. Sci Total Environ. 2023 Sep 9;904:166932. doi: 10.1016/j.scitotenv.2023.166932. Epub ahead of print. PMID: 37690759.

1、目前天昊微生物绝对定量测序是细菌和真菌都能检测吗？检测哪些区段？

答：是的。Accu16S®细菌绝对定量测序可以检测的区段包括16S rDNA的V3、V4、V3+V4和V4+V5区。AccuITS^TM真菌绝对定量测序可以检测的区段为ITS1和ITS2区。其他功能基因和18S rDNA暂不提供检测服务。

2、天昊微生物绝对定量测序能得到目前市场上其他公司的常规扩增子测序结果吗？

答：可以的。目前其他公司常见的常规扩增子测序就是传统的相对定量测序。我们绝对定量一次检测，可以提供常规的相对定量结果、绝对定量结果，以及两者比对分析结果。

3、天昊微生物绝对定量测序能检测什么样本？

答：研究领域涉及医学、环境、农学和生态等各个领域，样本类型包括人类及动物粪便、土壤、体外发酵液、水体生物膜、酒类发酵物及口拭子DNA样本等。

4、我们应该如何取样？

答：取样需要重点注意四个方面，即一致性、低温、洁净和备份。因为样本类型多样，如果不熟悉如何操作，可以在取样前，联系天昊技术人员进行咨询。

5、如果送到样本是DNA，应该注意哪些问题？

答：天昊绝对定量测序可以根据客户要求，选择用基于DNA水平或者样本水平进行分析（DNA水平：copies/ ng DNA；样本水平：copies/g土壤、粪便、copies/ L 水样等）。因此，如果客户寄送样本为DNA，而后希望按照样本水平进行分析，则客户在自己抽提DNA之前，需要对提取样本的重量或者液体体积进行记录。 

6、天昊绝对定量测序有生信分析的专属云平台吗？

答：有的。客户可以登陆我们的云平台进行数据的二次自主分析。