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m6A修饰RNA表达水平定量检测(MeRIP-qPCR)是将RNA免疫共沉淀与荧光定量PCR相结合的技术,通过特异性抗体富集total RNA中发生m6A甲基化修饰的RNA,借助特异性引物实现对m6A修饰的mRNA、lncRNA或circRNA进行定量的目的,可以应用于经MeRIP-seq发现的m6A修饰的基因(或已知的某个靶基因)在组间样本中m6A修饰水平的差异验证。
技术优势:
•特异性好:利用m6A甲基化特异性抗体进行富集,利用特异性引物进行定量检测;
•成本低:无需提前去除rRNA,样本需求量和检测成本较低;
•通量大:样本和检测位点数目灵活可变,多至384孔同时检测;
•精准度高:扩增和检测在同一管,不易污染;平行设置3个重复,减少系统误差。
样本类型:完整无基因组DNA污染的Total RNA
样本需求量:总量 ≥ 100 μg,浓度 ≥ 200 ng/μL
样本纯度:OD260/280 = 1.8~2.2,OD260/230 ≥ 2.0
样本完整度:Agilent 2100 Bioanalyzer 检测RIN值 ≥ 7.0,28S/18S ≥ 1.0
数据分析内容:
1) 目的基因的扩增曲线图 2) 目的基因的熔解曲线图 3) 目的基因的Ct值原始数据 4) 目的基因相对表达量分析数据及柱状图展示 注:每个检测设置三重复避免实验误差;每个样品对应一个总RNA样本(INPUT)和一个抗体富集RNA样本(IP),分别进行目的基因的定量检测;目的基因相对定量采用2-ΔCt法计算,其中ΔCt = Ct(IP) - Ct(INPUT)。 |
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