N6-甲基腺嘌呤（m6A）修饰是真核生物mRNA中普遍的内部修饰，通常m6A修饰嵌入在5’-DRACH-3’（D=G/A/U，R=G/A，H=A/U/C）保守的共有序列中，而且主要富集在终止密码子区域，表明m6A修饰的分布特征可能具有重要的生物学功能。m6A RNA甲基化测序（MeRIP-seq）是以RNA免疫共沉淀为基础，采用特异抗体对发生m6A甲基化修饰的RNA片段进行富集后测序的技术手段，能够准确识别100-200个核苷酸区域的m6A修饰，在RNA表观遗传学领域被广泛采用。

技术路线：

技术优势：

•开放的全转录组分析：无需预先设计探针，无需预知mRNA甲基化位点信息；

•信息量大：在全转录组水平上获得mRNA和poly(A)+长非编码RNA的甲基化修饰区域信息；

•准确性高：以未经抗体富集的mRNA文库作为input对照，校正mRNA表达量的影响，获得准确可靠的甲基化区域信息。

样本类型：完整无基因组DNA污染的Total RNA

样本需求量：总量 ≥ 100 μg，浓度 ≥ 200 ng/μL

样本纯度：OD260/280 = 1.8~2.2，OD260/230 ≥ 2.0

样本完整度：Agilent 2100 Bioanalyzer 检测RIN值 ≥ 7.0，28S/18S ≥ 1.0

数据分析内容：

结果展示：

图 样本reads分布的Fingerprints图

图 Peak在5'UTR、CDS和3'UTR区域内的分布

图 Peak在基因组各区域内的分布

Motif分析结果展示

图 Peak在不同样本中的可视化展示

Molecular Cancer：ALKBH5通过m6A修饰表观上抑制下游靶点LYPD1限制了肝细胞癌的恶性

    作者首先应用dot blot检测了ALKBH5对m6A修饰的调节作用。ALKBH5的缺失导致Huh7和MHCC97H细胞中m6A水平明显升高，而过表达ALKBH5则产生相反的结果（图A）。

    为了发现观察到的依赖ALKBH5表型的确切机制，作者利用稳定的ALKBH5过表达和载体转染的HCCLM3细胞（每组两个生物学重复），采用MeRIP-seq和RNA-seq相结合的方法。MeRIP-seq显示，当ALKBH5上调时，有1538个差异的m6A peaks丰度降低（1344个相应的转录本）。同时，RNA-seq发现了481个在ALKBH5过表达时下调的转录本。

    作者更重视甲基化模式和表达水平受ALKBH5调控的癌基因。因此只选择那些在ALKBH5过表达时同时具有低的m6A peaks和表达降低的转录本进行后续研究（图B）。为了进一步缩小候选基因的范围，集中在重叠的前10个基因，即COCH、LYPD1、ADAMTS14、ABCA4、TP53I11、COLCA2、TMED7、CYP4F3、IL17RB和VCAN。在ALKBH5沉默或过表达的细胞中通过qPCR进行初步验证（图C）。有趣的是，在所有三种肝癌细胞中，只有LYPD1始终被ALKBH5负向调控（图D-G），western blot结果进一步证实了这一点（图H）。综上所述，LYPD1可能是ALKBH5的直接下游靶点。

图 LYPD1被确定为ALKBH5的候选靶点

1.IGV软件使用说明？

答：IGV软件可以通过http://software.broadinstitute.org/software/igv/download下载，通过将.tdf加载到IGV软件中即可直观的显示基因组各个区域的覆盖度和测序深度，以及重复样品的平行性和不同样品之间的差异。

IGV软件中包含了包括人、小鼠、大鼠等个物种不同版本的基因组草图，这里选择Mouse mm10参考基因组，选择特定的染色体或者All选项可以查看不同染色体上的覆盖度和测序深度，输入特定的染色体区域或者基因名称可以查看相应区域的比对情况，右侧的“+”“-”可以对特定的显示范围进行放大和缩小。界面主体显示不同样本在特定区域内的测序深度，Refseq genes一栏中显示对应区域的基因结构信息。