作为一种重要的表观遗传学标记，DNA羟甲基化具有非常重要的生物学功能，不仅参与了DNA去甲基化过程，而且在染色体重编程、基因表达的转录调控等过程中发挥重要作用。已有大量研究表明羟甲基化异常与癌症、神经退行性疾病等复杂疾病密切相关，羟甲基化检测对生物学、转化医学等研究具有重要意义。

与5mC相比，5hmC在组织中含量更低，检测难度更大。随着高通量测序技术的发展，目前已有多种实验方法能够用于羟甲基化的检测，包括羟甲基化DNA免疫共沉淀测序（hMeDIP-seq）、TET辅助的亚硫酸盐测序（TAB-seq）、氧化-亚硫酸盐测序（oxBS-seq）等，但hMeDIP-seq无法达到单碱基分辨率，广泛使用的亚硫酸盐处理会造成DNA断裂损伤等问题的存在使羟甲基化检测受到限制。

新兴的APOBEC偶联表观遗传测序（ACE-seq）无需亚硫酸盐处理，处理起始量低，可在单碱基分辨率条件下进行5hmC的检测，开启了表观遗传研究的新探索。我们基于ACE-seq方法，依托公司多重PCR的专利技术，实现对多个特定CpG岛同时捕获测序，并凭借高深度测序数据，能够准确计算每个CpG位点的羟甲基化水平。该技术准确性高，起始量低，灵活性强，性价比优，为DNA羟甲基化研究提供有效的实验工具。

技术路线：

技术优势：

•低起始量：使用脱氨酶处理，减少基因组DNA损失，所需DNA起始量低；

•超高通量：同时检测多至数十个目标区域；

•精确定量：准确计算每个位点的羟甲基化水平；

•体系可靠：添加在样本中的spike-in可准确评估转化效率；

•高性价比：相较传统方法，基于二代测序更加经济、高效。

样品类型：溶解于蒸馏水或TE (pH 8.0)中的基因组DNA

样品需求量：Qubit检测，要求浓度≥20ng/μL，总量≥500ng（可检测30个片段）

样品纯度：样本无色透明，粘度低，琼脂糖凝胶电泳检测无挂孔

样品完整度：琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA完整性，要求电泳条带清晰可见，无明显降解，且无RNA污染

数据分析内容：

结果展示：

图 热图展示不同样品的CpG位点的相对羟甲基化水平

图 柱状图和箱式散点图展示分组样本CpG位点上的羟甲基化差异情况

图 CpG位点平均羟甲基化程度折线图

Journal of Hazardous Materials：β-氧化基因DNA羟甲基化重编程介导了成年小鼠早期砷诱发的肝脏脂质积累

为了探讨早期砷暴露是否对成年小鼠肝脏脂代谢相关基因表观遗传重编程产生影响，作者利用LC-MS/MS发现暴露组5mC和5hmC在基因组水平上并没有显著改变。利用天昊生物多重目的区域甲基化测序技术MethylTarget®对肝脏脂代谢相关基因Fasn, Srebf1, Cpt1α, Pparα, Atgl和Mttp的5mC修饰水平进行分析，发现部分基因的CpG片段甲基化水平发生改变（如图A-D）。同时，利用天昊生物基于ACE-seq自主设计的多重目的区域羟甲基化测序技术分析了这些基因的5hmC水平，部分片段的羟甲基化水平也发生了显著变化（如图E-H）。

图 早期砷暴露改变了小鼠成年后代肝脏脂代谢相关基因甲基化和羟甲基化

1.可以对候选基因同时检测其甲基化和羟甲基化水平吗？

答：就像上边发表的文献中呈现的，我们可以采用不同的方法对同一批样本的目的基因检测甲基化水平和羟甲基化水平，由于传统的甲基化检测方法无法区分甲基化修饰和羟甲基化修饰的位点，所以我们需要采取不同的策略分开检测。