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10X Genomics单细胞测序揭示动脉粥样硬化疾病中的保护机制


英文题目Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis
中文题目10X Genomics单细胞转录组测序提示平滑肌细胞表型转化与疾病候选基因TCF21在动脉粥样硬化过程中的保护作用
IF30.641
发表时间Volume 25 Issue 8, August 2019
作者信息美国斯坦福大学医学院
研究背景
 冠状动脉疾病(CAD)的最严重后果往往是由于"不稳定"的动脉粥样硬化病变斑块破裂,进而触发血栓闭塞,最终导致心肌梗死。与稳定的冠状动脉病变相比,这些脆弱的病变斑块的特点是较大的坏死脂质核心和外层较薄的纤维帽结构。
 为响应各种刺激,血管平滑肌细胞(SMC)可以去分化、增殖和迁移,这一过程被称为表型转化。然而,动脉粥样硬化时SMC的体内表型转化以及该过程对冠状动脉疾病(CAD)风险的影响尚不明确。传统认知,人们认为纤维帽的最内层如果存在更多的平滑肌细胞,那么动脉粥样硬化斑块就更加稳定,CAD的危险就越小。而近年的研究发现,血管平滑肌细胞(SMCs)极有可能通过表型转化的模式参与脆弱斑块的形成,并且通过表型转化进一步破坏病变的稳定性。
 前期研究还发现,斑块区的大部分平滑肌细胞不能被鉴定出(因为marker基因表达下调),一些平滑肌细胞被错误地鉴定为被称作巨噬细胞的免疫细胞,而一些源自巨噬细胞的细胞也能够伪装成平滑肌细胞。此外,一部分平滑肌细胞可转变为类似于干细胞和肌纤维母细胞的细胞。这些研究结果提示斑块区内的细胞组成非常混乱。
 TCF21 是一种转录因子编码基因,是CAD的一个致病基因,位于基因组6q23.2。这个基因如何参与斑块形成,如何参与CAD发病的具体机制仍然存在很多未知领域。

主要研究方法
 建立小鼠品系,应用血管平滑肌谱系跟踪的试验技术(lineage tracing),从而达到追踪血管平滑肌的目的。
 建立Tcf21 knockout小鼠模型。
小鼠主动脉根/上升主动脉细胞分离;人类冠状动脉细胞分离。
分选后10X Chromium单细胞测序:荧光激活细胞分选 (FACS)方法将从主动脉根和上升主动脉分离的细胞分为两组:tdT+(SMC origin细胞)和 tdT-(所有其他细胞)(基线;高脂饮食8周;高脂饮食16 周三个时间点)
 CITE-seq(Cellular Indexing ofTranscriptomes and Epitopes by sequencing,通过测序来进行转录组和表位的细胞索引技术)的新型测序技术,检测单细胞表面成千上万个表面蛋白标记物。
  RNAscope原位RNA检测。

研究结果
单细胞RNA测序(scRNA-Seq)确定了小鼠动脉粥样硬化过程的血管细胞组成:主要可分为SMC1和SMC2两个类群,而随着CAD病情的发展,出现了一组粉红色类群细胞---SMC表型转化类群(图abc),而且这个类群的细胞绝大多数为SMC来源(图d,即SMC转化而来)。同时,研究者发现Tcf21表达在 SMC 表型转化过程中上调(图f)。

    
 
图abc:小鼠主动脉根在基线,8周高脂,16周高脂饮食后的单细胞测序结果,可以看出粉红色类群细胞---SMC表型转化类群逐渐出现。
图d:所有时间点细胞混合后,按是否是SMC origin来源分组。可见,中间多个细胞类群,包括随疾病发生而出现的SMC表型转化类群,都是SMC来源的细胞。图e: 每个细胞类群的表达最高的8个基因。图f:Tcf21+细胞在不同细胞类型细胞群中的占比。

在体研究发现,SMC表型转化可形成独特的成纤维细胞样细胞,被命名为“fibromyocyte”,而不是转化为经典理论中的巨噬细胞表型。
 

图a: 小鼠主动脉根在各个时间点的总体细胞类群图
图b-f:按某个基因表达高低标记细胞类群图g: 按SMC转化分值标记细胞(分越高,表示转化程度越高)图h:Tagln表达水平变化和差异图 i:细胞类群变化的方向图j:SMC转化过程中差异基因最富集的通路

SMC中特异性敲除TCF21基因,单细胞测序提示fibromyocyte细胞占比显著下降,提示该基因敲除能够显著抑制小鼠中的SMC表型转化,从而导致病变斑块内以及病变斑块的保护性纤维帽内存在较少的fibromyocyte。
 

图:针对SMC中特异性敲除TCF21前后,小鼠SMC转化后的fibromyocyte(即SMC转化后细胞)的占比下降

在人类冠状动脉观察到了类似的SMC转化和成纤维肌细胞表型。
 

图a:人冠状动脉单细胞测序后的细胞类群
图b-e:按基因表达高低标记细胞图f:TNFRSF11B(fibromyocyte的一个marker)的RNA原位检测

TCF21 与 人类冠状动脉SMC 表型转化相关:通过关联分析发现,SMC分化后的marker与TCF21的表达负相关,提示TCF21高表达与SMC去分化有关,即TCF21表达与患者冠状动脉中的SMC表型转化显著相关。
 

图a: 与TCF21表达正相关的代表基因和负相关的代表基因。
图b:正相关基因集中于转化后的SMC,负相关基因集中于未转化的SMC。

CAD 风险碱基个数与 TCF21 表达减少相关,提示TCF21表达升高和SMC表型转化在CAD疾病中的保护作用。
 

图a:7个CAD基因组显著性SNP位点
图b:CAD 风险碱基个数与 TCF21 表达呈现负相关
 
研究结论

    使用单细胞RNA测序,本研究全面描述了在小鼠和人类动脉粥样硬化病变动脉中存在SMC的表型转化,并且发现这些细胞转化为独特的成纤维细胞样细胞,被称为"纤维肌细胞",而不是传统认为的经典的巨噬细胞表型。SMC 中特异性敲除TCF21 基因,表现出显著的小鼠SMC 表型转化抑制,导致小鼠体内病变处和保护纤维帽内的纤维肌细胞减少。此外,TCF21 表达与患病人类冠状动脉的SMC表型转化显著相关,高TCF21表达水平与人类CAD低患病风险有关。这些结果确立了TCF21和SMC表型转化在该疾病中的保护作用。



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