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 鱼和熊掌不可兼得?不,两者我都要!


鱼,我所欲也,熊掌亦我所欲也;
鱼,我所欲也,熊掌亦我所欲也;
    二者不可得兼,舍鱼而取熊掌者也。
——孟子《鱼我所欲也》

    鱼和熊掌,二者取其一,是古代贤能告知我们不要贪心,要学会取舍,在我们微生态群落研究中也会遇到同样的问题,相对定量(序列相对比例)分析和绝对定量(16S 拷贝数)分析,不知道选哪个?要不两个都要?两个放在一起对比一下看看?有这些想法的老师同学们不要担心,因为我们天昊生物可以帮您成全“鱼与熊掌”兼得的美事。
    我司于去年下半年推出微生物16S扩增子绝对定量测序技术以来,微生物16S扩增子绝对定量测序项目报告不但同时提供相对定量和绝对定量两套分析结果,同时兼顾客户研究方便的考量,精益求精,贴心地将基于相对定量数据(Relative Quantitation,下文简称RQ)分析结果和基于绝对定量数据(Absolute Quantitation,下文简称AQ)分析结果进行联合对比分析,找出不同定量分析方法得到的结果异同,下面我们就节选一部分两种分析方法的联合分析结果(群落组成对比分析)做相应展示。
 
群落组成对比分析原因
 

    上图是微生物绝对定量分析(AQ)和相对定量分析(RQ)最大差异的体现之处,但是哪些差异物种是两种定量分析方法共同筛选到的?哪些差异物种是某种定量分析方法特异筛选到的?另外两种定量方法中筛选到的差异物种组间变化趋势是否相同?带着这些疑问,我们对绝对定量分析结果(AQ)和相对定量分析结果(RQ)进行联合对比分析。
 
群落组成对比分析结果展示

Wilcoxon结果比对分析
    Wilcoxon秩和检验,是一种常用于分析两两分组间的样本总体分布是否存在差异的非参数检验方法。利用Wilcoxon秩和检验对两两分组间样本进行比较,在各分类水平上找出两组中具有显著差异的物种,以P < 0.05作为差异显著性筛选阈值,对于组间丰度显著差异的物种绘制箱体图。
    本分析对比各分类水平上RQ(相对定量分析)和AQ(绝对定量分析)的Wilcoxon秩和检验结果,找出以下3类物种:
1) 在RQ和AQ分析中,组间差异均显著的物种,
2) 仅在RQ分析中,组间差异显著的物种,
3) 仅在AQ分析中,组间差异显著的物种。
    下图是纲水平(class)两种定量方法的差异物种分布比较Venn图展示结果。


 
 
图1  两种定量方法的差异物种分布比较Venn图
 
注:不同的颜色表示不同定量方法,不同颜色圆圈重叠的区域标注数字表示共有的物种数。
 
 

 
 
图2 两种定量方法中差异物种的对比箱体图
 
注:不同颜色分别代表样本不同组别,横坐标表示该分类水平的差异物种,纵坐标为相对丰度(左:基于RQ)和绝对丰度值(右:基于AQ);显著性标记:**** P<0.0001,*** P<0.001,** P<0.01,* P<0.05。

Kruskal_Wallis结果比对分析
    Kruskal-Wallis检验是一种常用于分析多组样本间的总体分布是否存在差异的非参数检验方法。利用Kruskal-Wallis检验对3组以上的组间样本进行比较,在各分类水平上找出组间差异显著的物种。以P < 0.05作为差异显著性筛选阈值,对于组间丰度显著差异的物种绘制箱体图。
    本分析对比各分类水平上RQ(相对定量分析)和AQ(绝对定量分析)的Kruskal-Wallis方差分析结果,找出以下3类物种:
1)在RQ和AQ分析中,组间差异均显著的物种,
2)仅在RQ分析中,组间差异显著的物种,
3)仅在AQ分析中,组间差异显著的物种。
    下图是纲水平(class)两种定量方法的差异物种分布比较Venn图展示结果。
 

 
图3 两种定量方法的差异物种分布比较Venn图
 
注:不同的颜色表示不同定量方法,不同颜色圆圈重叠的区域标注数字表示共有的物种数。
 
 

 
 
图4两种定量方法中差异物种的对比箱体图
 
注:不同颜色分别代表样本不同组别,顶部标题表示该分类水平的差异物种,纵坐标为相对丰度(左:基于RQ)和绝对丰度值(右:基于AQ)。

ANOVA结果比对分析
    ANOVA方差分析用于两个及两个以上分组均数差别的显著性检验,在各分类水平上找出多组中具有显著差异的物种。以p value < 0.05作为差异显著性筛选阈值,对于组间丰度显著差异的物种绘制箱体图。
    本分析对比各分类水平上RQ和AQ的ANOVA方差分析结果,找出以下3类物种:
1)在RQ和AQ分析中,组间差异均显著的物种,
2)仅在RQ分析中,组间差异显著的物种,
3)仅在AQ分析中,组间差异显著的物种。
    下图是纲水平(class)两种定量方法的差异物种分布比较Venn图展示结果。
 

 
 
图5 两种定量方法的差异物种分布比较Venn图
 
注:不同的颜色表示不同定量方法,不同颜色圆圈重叠的区域标注数字表示共有的物种数。
 
 

 
 
图6 两种定量方法中差异物种的对比箱体图
 
注:不同颜色分别代表样本不同组别,顶部标题表示该分类水平的差异物种,纵坐标为相对丰度(左:基于RQ)和绝对丰度值(右:基于AQ)。
 
 

 
 
图7 两种定量方法中差异物种组间变化趋势的对比折线图
 
注:不同的颜色表示不同定量方法,顶部标题表示该分类水平的差异物种,纵坐标为相对丰度(左:基于RQ)和绝对丰度值(右:基于AQ),errorbar为标准误SE。
 
 
实验数据总结


    上述实验数据结果说明是微生物相对定量分析(RQ)和绝对定量分析(AQ)在群落组成分析方面可能存在差异,具体表现在:(1)两种定量分析方法可以筛选到共同的差异物种;(2)两种定量分析方法可以筛选到各自特异的差异物种;(3)两种定量分析方法中筛选到的差异物种组间变化趋势可能有所不同。
    以上就是天昊16S扩增子绝对定量测序部分更新内容和亮点,当然我们也会继续升级有应用价值的分析内容,感兴趣的小伙伴们可以关注天昊生物微信公众号,小编会不定期更新哦。
 
客户合作情况


    作为国内唯一一家提供 “微生物16S扩增子绝对定量测序”技术的服务商,我们首先感谢客户的信任和选择,仅仅在2018年第四季度,微生物16S扩增子绝对定量测序技术平台已经完成项目数十个,合作的单位包括中国科学院南京土壤研究所、中国科学院水生生物研究所、厦门大学环境与生态学院、中国农业大学、南京农业大学、东北农业大学、重庆市农业科学院、盐城工学院、南京财经大学、南京中医药大学、武汉大学中南医院、新疆医科大学公共卫生学院、温州医科大学、山东大学齐鲁医院等多个单位,覆盖环境微生物和肠道微生物等领域。
    2019年,我们期待,与您的合作!



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