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疾病全转录组测序分析和后续功能研究最新范例


1、Endometriosis-related ceRNA network to identify predictive biomarkers of endometrial receptivity
题目:子宫内膜异位症相关ceRNA网络用于识别子宫内膜容受性的生物标志物预测
发表杂志:Epigenomics 影响因子:4.979  发表日期:2019-2


研究背景
    子宫内膜异位症影响大约5-15%的育龄妇女,是一种良性妇科疾病,它与骨盆疼痛和不孕有关。因此,从研究胚胎植入失败的机制中获得的知识可能有助于制定具体的治疗措施,优化胚胎植入。特别是,子宫内膜异位症患者在位子宫内膜在着床期间分子差异的发现代表着了解这种情况的发病机制以及开发治疗子宫内膜异位症相关子宫内膜容受性缺陷的新策略的重要一步。据报道lncRNAs的失调可能会影响子宫内膜容受性。
ceRNA理论提出极大地扩展了人类基因组中的功能性遗传信息,在病理状况中发挥了重要作用。本研究的目的是构建子宫内膜异位症相关的lncRNA-miRNA-mRNA网络,探索可能作为子宫内膜容受性生物标志物的关键RNA。
研究方法
组织收集
    共有16名女性不孕患者参加了这项研究。子宫内膜活检取自手术和组织学证实的子宫内膜异位症患者(n=8)和手术中发现无子宫内膜异位症的患者(n=8)。
实验分析方法
    RNA isolation and RNA-Seq analysis、immunohistochemistry、differentially expressed genes screening、ceRNA network analysis & construction、pathway analysis、topological analysis、key genes and key lncRNA–miRNA–mRNA subnetwork selection、bidirectional clustering。
研究结果
 

图1、本研究技术路线图

免疫组织化学
    通过免疫组织化学判断,ERα、PR-B和PR-A/B的表达模式在正常组和子宫内膜异位症组之间发生了变化。根据IRS测定,子宫内膜异位症患者在PR-A/B和PR-B受体方面表现出较低水平的上皮子宫内膜表达。
子宫内膜异位症患者全转录组测序分析
    与子宫内膜异位症组相比,正常组共检测到767个mRNAs (181个上调和586个下调)、231个mRNAs (99个上调和132个下调)和45个mRNAs (11个上调和34个下调)。火山图和散点图显示了两组之间lncRNA、mRNA和miRNA表达的变化。
 
 
图2、火山图显示了正常人和患者间lncRNA、mRNA和miRNA差异表达情况
 
LncRNA–miRNA–mRNA关联分析
    为了预测lncRNAs作为miRNA靶的功能,重构了lncRNAs、miRNAs和mRNAs之间的网络,然后可视化。LncRNA–miRNA–mRNA网络由155个lncRNA节点、132个mRNA节点、40个miRNA节点和463个边缘组成。
通路分析
    对上述ceRNA网络中的DELs、DEMs和DEMs进行GO分类和KEGG途径的富集分析,以推测差异表达RNA类型的潜在功能。GO分子功能分析确定了41个富集的GO项。KEGG通路、分析的结果表明,这些基因可能参与了 “氧化应激”、“L1和锚蛋白之间的相互作用”、“视黄醇代谢”和“药物代谢”途径等。
拓扑分析与关键基因的选择
    在通过DELs、DEMs和DEMs的拓扑分析来识别ceRNA网络的中心节点的前25个基因中,重叠基因被选为ceRNA进一步分析的关键基因。基于差异表达RNA的倍数变化,分层聚类分析揭示了正常组与子宫内膜异位症组样本RNA表达的概况。
研究者使用12个关键RNA构建了ceRNA子网。进一步发现与子宫内膜异位症相关的关键差异表达mRNAs与GO分析中的38条路径和KEGG分析中的30条路径相关,包括“蜕膜化”、“VEGF信号通路”、“TNF信号通路”和“卵巢类固醇生成”。
 

图3、CeRNA子网12个基因情况。子网包括30个mRNAs (蓝色节点)、26个mRNAs (绿色节点)和32个mRNAs (红色节点)。虚线强调了可能在子宫内膜容受性中起作用的注释。

lncRNAs–mRNAs–miRNAs的共表达与功能预测
    通过皮尔逊相关分析进一步选择了ceRNA子网中包含的lncRNAs、miRNAs和mRNAs用于双向聚类,结果发现了两个共表达模块,包括模块1的12个mRNA和模块2的18个mRNAs。
 

图4、模块1(A)和模块2(B)的lncRNA–mRNA/miRNA–mRNA共表达网络

研究结论
    在这里,研究者对子宫内膜异位症患者子宫内膜容受性受损者进行了全转录组测序分析,探讨了lncRNA在调节子宫内膜容受性中的作用以及ceRNA机制的功能,构建了一个子宫内膜异位症相关的lncRNA-mRNA-miRNA调控网络,探索可以作为指示子宫内膜容受性的生物标志物的关键RNA。
 
2、lncRNA-ES3/miR-34c-5p/BMF axis is involved in regulating highglucose induced calcification/senescence of VSMCs
题目:lncRNA-ES3/miR-34c-5p/BMF轴参与调节高糖诱导的血管平滑肌细胞钙化/衰老
发表杂志:Aging 影响因子:4.867  发表日期:2019-1
 

研究背景
    血管老化在糖尿病患者中非常常见,它可以影响心血管疾病的阈值、进展、严重程度和预后。血管钙化也是血管老化的一个重要表型,是糖尿病患者大血管并发症的常见影响之一。然而,很少有报道研究高糖对血管平滑肌细胞钙化/衰老的影响。此外,高糖诱导VSMC钙化/衰老的机制仍不清楚。
研究方法
    qRT-PCR、RNA interference、western blot analysis、luciferase reporter assay、RNA pull-down assay、RNA immunoprecipitation (RIP) assay。
 
研究结果
研究者发现在高糖诱导的HA-VSMCs钙化/衰老过程中,miR-34c-5p的表达降低
    为了证明miR-34c-5p是否参与调节HA-VSMCs的钙化/衰老,分别使用增益和丧失功能的方法来过度表达或抑制miR-34c-5p的表达。MiR-34c-5p模拟物和抑制剂被转染到HA-VSMCs中,以过度表达或抑制miR-34c-5p的表达。qRT-PCR结果显示miR-34c-5p模拟物诱导miR-34c-5p水平增加约50倍,miR-34c-5p抑制剂显著降低miR-34c-5p的表达,这些数据表明miR-34c-5p在HA-VSMCs的钙化/衰老过程中起着负面作用。
 
lncRNA-ES3通过直接相互作用抑制miR-34c-5p的表达
    生物信息学分析显示miR-34c-5p和lncRNA-ES3之间存在一些互补位点。此外,qRT-PCR证实了用HG处理的HA-VSMCs中lncRNA-ES3的水平显著升高。研究进一步探索miR- 34c-5p是否可以直接与lncRNA-ES3相互作用。通过Pull-down等实验验证miR-34c-5p序列可以与lncRNA-ES3高度结合。结果表明,lncRNA-ES3和miR-34c-5p可以在HA-VSMCs中相互结合。
 
BMF是miR-34c-5p的目标
    生物信息学分析显示,预测BMF的3’UTR区域包含miR-34c-5p的一些潜在结合位点。在培养的HA-VSMCs中,miR-34c-5p的过度表达显著降低了BMF的mRNA和蛋白水平,而miR-34c-5p抑制剂它们则显著增加。荧光素酶测定表明miR-34c-5p的强表达显著抑制WT-BMF报告者的荧光素酶活性,而在miR-34c-5p过度表达后,Mut-BMF报告者的荧光素酶活性没有观察到变化。Western印迹进一步显示,lncRNA-ES3的沉默能迅速抑制BMF表达。收集起来,这些数据表明BMF是miR-34c-5p的目标,lncRAN-ES3充当miR-34c-5p的ceRNA,调节HA-VSMCs中目标基因BMF的表达。
 
miR-34c-5p抑制HA- VSMCs的钙化/衰老,而lncRNA-ES3和BMF促进HA-VSMCs的钙化/衰老
    为了探讨miR-34c-5p在HA-VSMCs钙化/衰老中的生物学作用,本文发现miR-34c-5p的过度表达减弱了HG诱导的HA-VSMCs钙化,ALP活性、OC分泌、Runx2表达和矿化结节的形成。与此同时,p16和p21表达减少,SA-β-gal阳性细胞染色,证实用miR-34c-5p模拟物转染的HA-VSMCs的衰老也明显减轻。为了评价lncRNA-ES3和BMF对HA-VSMCs钙化/衰老的影响,分别用sLNcRNA - ES3和siBMF抑制了lncRNA-ES3和BMF在HA-VSMCs中的表达。结果表明,lncRNA-ES3或BMF的沉默显著减弱了高葡萄糖刺激的HA-VSMCs钙化/衰老,这一点通过ALP活性、OC分泌、Runx2、p16和p21表达的降低、矿物质化结节以及SA-β-gal阳性细胞的染色得到证实。综上所述,这些结果表明miR-34c-5p下调与HA-VSMCs的钙化/衰老有关,这一机制可能是由高糖诱导的HA-VSMCs中的lncRNA- ES3和BMF介导的。
 

图5、miR-34c-5p抑制了HA-VSMCs的钙化/衰老,而lncRNA-ES3和BMF促进了HA-VSMCs的钙化/衰老。

研究结论:
    在本研究中,研究者发现BMF是miR-34c-5p的靶基因,lncRNA-ES3也有miR-34c-5p的一些互补位点。通过探索lncRNA-ES3/miR-34c-5p/BMF在血管平滑肌细胞钙化/衰老中的潜在作用和分子机制,为尿病血管衰老的潜在治疗寻找靶点。
 
全转录组测序技术优势:

●    rRNA去除建库,保留了完整的RNA种类信息;
​●    链特异性文库,可以保留转录本的链信息,更准确地检测反义RNA;
​●    使用高通量测序,能够获得更加全面的RNA信息,包括低丰度的RNA;
​●    通过测定的序列信息精确地分析不同类型RNA的表达丰度变化及其生物学功能;
​●    分析同一样本中的mRNA、lncRNA、miRNA和circRNA四种类型RNA,明确这些RNA之间的共表达和调控关系,揭示ceRNA调控机制。
 
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