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DNA N6-methyladenine(6mA)中的明星分子和检测方法


    在我们年初的一篇分享中《潜在热点?——DNA 6mA甲基化修饰》,我们总结了human样本中涉及DNA N6甲基腺嘌呤修饰(6mA)的6篇文章。本期我们针对文章中有关6mA修饰常用的检测方法和调控的基因/酶做了简单的梳理,另外近期该领域又发表了一些新的paper

方法

    从2019年3月最新的一篇Nature综述中总结的利用现代测序技术解码细菌表观基因组能够看出,单碱基分辨率条件下用于6mA检测的方法有限制酶消化后测序、单分子实时测序、纳米孔测序。其中三代测序SMRT和Nanopore能够直接检测DNA甲基化修饰,无需PCR扩增的步骤[1]。之前解读的human样本一篇文献就有利用到SMRT的方法(下图1)[2]。


 
图1 SMRT用于6mA检测

    从2015年的Nature(图2)和Cell(图3)综述中可以看出更加常用的方法包括基于免疫沉淀(IP)和质谱(LC-MS/MS)的检测[3, 4],尤其是基于IP的方法
 

 
图2 Nature综述中6mA检测方法总结
 

图3 Cell综述中6mA检测方法总结

    基于6mA-IP-seq方法检测6mA相关的research文章包括human样本中涉及恶性胶质瘤6mA修饰[5]、人类基因组6mA修饰图谱等[6](图4)。测序后可以利用6mA-IP-qPCR对目的基因进行验证分析。
 



图4 6mA-IP-seq策略研究6mA修饰

    通常这些文章中经常还会设计dot blot(图5A)和质谱实验(图5B)检测6mA修饰总体水平以及6mA/A比例。基于6mA-IP也可以用于6mA总体水平定量这些研究策略类似于m6A RNA甲基化常用的方法!
 

图5 Dot blot和MS用于6mA总体水平定量

    另外还有些文章开发新的方法或者对IP策略进行改进利用在6mA检测中,包括免疫荧光用于6mA可视化检测等[5, 7, 8]。

修饰酶

    从最新的2019年3月份Nature有关DNA修饰的综述中总结中可以发现不同物种中6mA修饰和去修饰相关的酶(图6)[9]。
 


图6 DNA修饰及相关修饰酶

    其中在human样本中关注度比较高的为6mA去甲基化酶ALKBH1,如先前解读的human样本Cell [5]、Molecular Cell [6]、Bone Research [10]文章,Molecular Cell也研究了N6AMT1这一甲基化转移酶的作用。而NAR上突破性文章曾报道SSBP1作为6mA结合蛋白在线粒体DNA修饰和复制中的作用,同时也发现ALKBH1作为一种线粒体蛋白与6mA去甲基化酶相关[11]。目前来看在人类样本中经验证的修饰酶的种类比较有限,期待后续更多的新发现。
 
数据库

    最后介绍一个数据库MethSMRT,SMRT测序整合的6mA和4mC数据,由中山大学开发,但是目前收录的物种没有人,网址链接http://sysbio.sysu.edu.cn/methsmrt/[12]。
 


图7 MethSMRT数据库收录物种

1、    Beaulaurier, J., E.E. Schadt, and G. Fang, Deciphering bacterial epigenomes using modern sequencing technologies. Nat Rev Genet, 2019. 20(3): p. 157-172.
2、    Zhu, S., et al., Mapping and characterizing N6-methyladenine in eukaryotic genomes using single-molecule real-time sequencing. Genome Res, 2018. 28(7): p. 1067-1078.
3、    Luo, G.Z., et al., DNA N(6)-methyladenine: a new epigenetic mark in eukaryotes? Nat Rev Mol Cell Biol, 2015. 16(12): p. 705-10.
4、    Heyn, H. and M. Esteller, An Adenine Code for DNA: A Second Life for N6-Methyladenine. Cell, 2015. 161(4): p. 710-3.
5、    Xie, Q., et al., N(6)-methyladenine DNA Modification in Glioblastoma. Cell, 2018. 175(5): p. 1228-1243 e20.
6、    Xiao, C.L., et al., N(6)-Methyladenine DNA Modification in the Human Genome. Mol Cell, 2018. 71(2): p. 306-318 e7.
7、    Liu, B., et al., Metabolically Generated Stable Isotope-Labeled Deoxynucleoside Code for Tracing DNA N(6)-Methyladenine in Human Cells. Anal Chem, 2017. 89(11): p. 6202-6209.
8、    Liu, X., et al., Predominance of N(6)-Methyladenine-Specific DNA Fragments Enriched by Multiple Immunoprecipitation. Anal Chem, 2018. 90(9): p. 5546-5551.
9、    Deniz, O., J.M. Frost, and M.R. Branco, Regulation of transposable elements by DNA modifications. Nat Rev Genet, 2019.
10、  Zhou, C., et al., DNA N(6)-methyladenine demethylase ALKBH1 enhances osteogenic differentiation of human MSCs. Bone Res, 2016. 4: p. 16033.
11、  Koh, C.W.Q., et al., Single-nucleotide-resolution sequencing of human N6-methyldeoxyadenosine reveals strand-asymmetric clusters associated with SSBP1 on the mitochondrial genome. Nucleic Acids Res, 2018. 46(22): p. 11659-11670.
12、  e, P., et al., MethSMRT: an integrative database for DNA N6-methyladenine and N4-methylcytosine generated by single-molecular real-time sequencing. Nucleic Acids Res, 2017. 45(D1): p. D85-D89.



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