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10X Genomics单细胞RNA测序在动植物研究中的最新进展


        多细胞生物中不同细胞类型和细胞特异性功能的产生,很大程度上是基因表达差异的结果。单细胞RNA测序(scRNA-seq)方法的发展,已经彻底改变了我们对单个细胞内部和之间基因表达的理解。随着单细胞RNA测序商用平台,特别是10X Genomics的推广应用及生信分析方法的不断完善,研究者只要利用好手里的特色样本(例如动植物特有物种或者突变体等组织样本),通过天昊生物提供的10X Genomics细胞分选系统+高通量测序一站式服务,就可以在单细胞水平高效的分析转录组情况,快速占领单细胞研究领域的前沿高地。下面就跟大家分享两篇在植物和动物单细胞RNA测序方面的最新研究进展。

1、Single-cell RNA sequencing resolves molecular relationships among individual plant cells

题目:单细胞RNA测序解析单个植物细胞之间的分子关系


        单细胞RNA测序(scRNA-seq)已广泛用于研究动物细胞特异性基因表达,但尚未广泛应用于植物。本研究报道了一种基于商用液滴微流体平台(10X Genomics)的高通量scRNA-seq方法,从超过10000拟南芥根细胞原生质体中获得单细胞转录组。研究发现,所有主要组织和发育阶段都存在于这种单细胞转录组群体中。此外,还鉴定了不同的亚群和稀有细胞类型,包括可能的静态中心细胞。根表皮细胞转录组的集中分析定义了从分生组织到根毛和非毛细胞分化成熟阶段的各个细胞的发展轨迹。此外,单细胞转录组是从根表皮突变体中获得的,能够以单细胞分辨率对基因表达进行比较分析,并对突变基因的影响提供了前所未有的视角。总的来说,这项研究证明了scRNA-seq在植物中的可行性和实用性,并提供了单细胞分辨率下拟南芥根的第一代基因表达图谱。

实验材料及结果

拟南芥根尖单细胞转录组分析

        本研究使用10X Genomics Chromium平台从野生型拟南芥根尖原生质体的三个生物学重复中获得总共7522个单细胞转录组数据(图1A)。每个细胞平均获得了大约75000条reads及5000个表达的基因,所有细胞群体中检测到的总基因共计22000多个。
        通过绘制单细胞转录组t分布随机邻域嵌入(tSNE)图,发现从每个生物重复样本产生了大量重叠的细胞分布,表明重复结果具有高度的再现性(图1B)。使用Seurat无监督聚类方法得到九个主要的细胞转录组聚类簇(图1C)。研究人员还根据在特定根组织/细胞类型中表达的86个标记基因的表达,生成整个细胞群体中所有标记基因的转录组合图(图1D),以及每个标记基因的转录表达图(图1E和F)。总的来说,这一分析展示了特定细胞群被分配到中柱组织(群0和5)、根毛表皮细胞(4和8)、非毛表皮细胞(3)、皮层(6)、内皮层(7)、分生组织内皮层(2)和根冠(1) (图1G)。这表明scRNA-seq成功地得到了代表所有主要根尖组织类型的细胞转录组数据。

 
 
图1、野生型拟南芥根单细胞转录组的分离和聚类分析

       接下来研究者对组织内特定细胞类型相对应的主要簇内的细胞亚簇进行了识别,主要集中在中柱细胞分析上。通过使用韧皮部或木质部内特定细胞类型的特异性标记基因,包括原韧皮部筛细胞、韧皮部伴细胞和原木质部细胞,并在代表这些细胞类型的相应韧皮部或木质部簇中发现了相对较小的亚簇(图2)。这些结果表明,单细胞转录组数据集足以识别不同的和相对稀少的细胞亚型。
 

 
图2、通过tSNE投影图上的中柱标记基因表达情况来识别中柱中不同细胞类型的簇。颜色强度表示每个细胞中指定基因的相对转录水平。


        对于一些基因来说,转录水平在单个簇的细胞中有所不同,这表明基因表达存在潜在的发育梯度。例如,SCR在薄壁组织(分生组织内皮层)簇的一端优先转录(图3A),而UBP1主要在分化根细胞的伸长阶段表达,表现出多个簇细胞差异转录本积累(图3B)。研究者分析了在分生区或分化区优先表达的基因,确定了在群体中每个细胞中表达的分生基因与分化基因的比率,获得所有细胞分化状态图谱,揭示了最不成熟(即分生组织)的细胞位于tSNE的中心,逐渐向外部分化的细胞发散(图3C)。
 
 
图3、基因表达在簇内的发育变化

表皮和静态中心细胞分析

        本研究将代表表皮组织和发育相关根冠组织的单细胞转录组(图1C中的簇1、3、4和8)重新聚类,产生11个较小的细胞簇(图4A)。通过分析这些簇中差异表达的基因和根表皮和根冠的43个标记基因的转录积累(图4B),定义了代表根毛细胞(簇1、2、3)、非毛细胞(簇0、8、9)和小柱根冠细胞(簇10)的簇。为了描述基因在表皮细胞中的表达模式,研究者首先分析了前人报道的根毛基因和52个先非毛基因的表达。分别跨越根毛簇和非毛簇中的细胞(图4C和D)。这些热图显示了细胞分化过程中不同基因表达波动。
        有趣的是,最不成熟根毛和非毛表皮细胞的簇(簇2和簇9)由簇7连接,这暗示簇7中的两种表皮细胞类型有一个共同的发育起点。研究者通过拟时轨迹分析,推断了根毛细胞和非毛细胞的发育轨迹 (图4E和F)及R的Destiny包扩展映射图(图4G),并用实验检测了几种已知的根毛细胞分化早期标记物(MYC1EGL3RHD6)和非毛细胞分化早期标记物(TTG2GL2ETC1)的转录积累,发现表达这些早期标记物的细胞起源于簇7 (图4H)。
 
 
图4、根表皮和根冠组织单细胞转录组分析


        为了进一步探讨表皮细胞的起源,根据各个细胞内早期根毛细胞调节子(MY1EGL3RHD6)和非毛细胞调节子(TTG2GL2ETC1)基因表达的重叠程度,发现簇7中的大部分细胞表达至少一个根毛标记基因和一个非根毛标记基因(图5A),这意味着这些细胞某种程度的细胞命运不稳定,可能代表表皮细胞谱系的起源。
        静态中心(QC)细胞位于拟南芥根分生组织中的根表皮干细胞附近。利用52个已知的QC表达标记基因,研究者发现簇7下部的相对小的一组细胞始终表现出QC标记表达(图5B),鉴定了两个表现出最大程度QC标记基因表达的细胞(图5C),并鉴定了在2个假定的QC细胞中表达但在其他21个细胞中没有表达的6个基因,在分析了它们在所有单细胞转录组中的转录累积后,发现其中一个基因(AT2G39220或PLP6 )基本是QC特异性的(图5D)。这些结果表明, scRNA-seq数据集能够识别代表稀少群体的细胞转录组。
 

 
图5、静态中心( QC )细胞的鉴定


rhd6gl2根表皮突变体的单细胞分析

        接下来,本研究探讨了scRNA-seq在单细胞分辨率下分析突变体表型的应用。使用rhd6突变体和gl2突变体根原生质体进行单细胞转录组检测,rhd6突变体基本上缺少根毛细胞,gl2突变体缺少非毛细胞。将这些单细胞转录组与野生型细胞转录组数据放在一起分析,得到12个主要簇(图6A和B)。分析结果发现位于根毛细胞群中的rhd6细胞转录组的比例显著下降,非毛细胞群中gl2细胞转录组的比例也降低 (图6C)。然后使用单细胞转录组来分析rhd6gl2突变体中异常表皮细胞的特征。通过检查在相对早期启动表达的根毛标记基因,研究者检测到rhd6转录组中的非毛细胞群体不正常地表达这些早期根毛细胞标记。类似地,也检测到表达早期非毛发标记基因的gl2细胞转录组的群体。这些发现表明,一些rhd6gl2突变表皮细胞分别保留了表达毛发细胞基因和非毛发细胞基因的能力,这意味着这些突变不会阻断所有毛发/非毛发途径基因的表达,因此不会完全将一种表皮细胞类型转化为另一种。这也再次证明了scRNA-seq数据在确定细胞亚群和以单细胞分辨率表征突变表型方面的有效性。
 

 
图6、野生型和根表皮突变体单细胞转录组比较结果


2、Single-cell transcriptome provides novel insights into antler stem cells,a cell type capable of mammalian organ regeneration
 
题目:单细胞转录组为鹿茸干细胞这类可使哺乳动物器官再生的细胞提供新的见解

 

        鹿角再生是一种基于干细胞的表面再生过程,有潜力成为再生医学的一个有价值的模型。用于鹿茸发育的鹿茸干细胞库位于鹿茸骨膜中。然而,这个ASC库是同质的还是异质的还并不十分清楚。在本文中,研究者首次使用10X Genomics平台,通过单细胞转录组测序方法(scRNA-seq)鹿茸干细胞进行了测定。共有4565个鹿茸干细胞被测序并组成一个大的细胞群,这表明在AP的ASC可能是一个同质群体。scRNA-seq数据显示,肿瘤相关基因在这些同质ASCs中高度表达。对干细胞标记物的筛选结果表明,干细胞可能被认为是胚胎干细胞(CD9)和成体干细胞(CD29、CD90、NPM1和VIM)之间的一种特殊类型的干细胞。本研究结果第一次在单细胞水平上对鹿茸干细胞转录组进行了综合分析,并且只鉴定出了鹿茸骨膜中的一种主要细胞类型和一些关键的干细胞基因,这可能是为什么鹿角这种独特的哺乳动物器官一旦丢失就能完全再生的关键。

实验材料及结果

       本研究通过对鹿茸骨膜(AP)细胞的分离,获得含有约7500个细胞的细胞悬浮液,利用10X Genomics平台标准的细胞分选流程及后续高通量测序,完成单细胞转录组检测。

高质量scRNA-seq数据的获得

       实验共获得252818309个reads被映射到14993个基因上,这些基因在4731个鹿茸干细胞(ASCs)中表达。条形码UMI计数曲线的急剧下降,表明细胞相关条形码与空液滴的良好分离(图1a)。通过基因数量(图1b)和线粒体基因的百分比(图1c)相对于每个细胞相应UMI数结果,排除异常潜在的多细胞小液滴,最终共保留了4615个单细胞和13173个基因用于后续分析。
 

 
 
图1、使用10X Genomics对ASC单细胞转录组测序的质控结果


ASC大细胞聚类群

       基于不依赖已知标记的最近邻域类算法,从4615个高质量细胞中得到两个细胞簇(图2a)。进一步根据基因表达将这些细胞分成两个不同的细胞群(图2b)。研究者在小簇(50个细胞)中没有发现上调基因。然而,大量下调的线粒体基因被表达,这强烈表明小簇可能被ASCs碎片污染。发现大细胞群( 4565个细胞)中的ASCs表达高水平的细胞外基质蛋白,如胶原蛋白家族,这些基因通常被用于测量从间充质干细胞到成骨细胞、骨祖细胞和软骨基因增生的分化状态。基于0.2的更高分辨率,大细胞群又可被分成两个群,分别有2404个和2161个细胞(图2c),但是只有四个基因的绝对对数具有2倍变化值(图2d),表明AP中的ASC群体可能代表相似群体。
 


图2、基于无监督图的ASCs t-SNE分析


ASCs中高表达基因

       总共有35个基因被发现在大细胞群的细胞中高表达,基于它们的表达水平对它们进行进一步分类(图3a)。使用免疫荧光染色进一步证实TMSB10、LGALS1 (图3b)和VIM (图4a ) 蛋白的高表达。在所选的35个基因中,25个被发现参与了蛋白质-蛋白质相互作用网络(图3c),这表明它们可能会聚集在一起以适应ASCs中的特定生物功能。
 

 
 
图3、scRNA-seq中高表达基因验证及分析


干细胞标志物的表达

       为了研究干细胞标志物在大细胞群中的表达状况,研究者基于两个标准从scRNA-seq数据中选择了16个标志物基因:(1)在至少一个UMI计数中表达,(2)在超过3 %的ASCs中表达。这16种标记基因随后根据文献中每种类型的定义,被分成四种类型的干细胞标记:间充质干细胞标记、胚胎干细胞标记、神经干细胞标记物和癌症干细胞标志物 (图4a)。当表达水平设定为nUMI>5时,发现超过40 %的ASCs中表达了四种间充质(CD90、CD29、VIM和NPM1)和一种胚胎干细胞标记基因(CD9) (图4b)。
 

 
 
图4、使用干细胞标记物的ASC筛选结果

       使用免疫荧光染色进一步证实了这五种干细胞标基因的高表达水平(图5a)。为了进一步调查这五个标记基因中每一个的阳性细胞比例,进行流式细胞FACS多色分析,结果显示CD9+、CD90+、CD29+、VIM+和NPM1+分别在91.1 %、93.2 %、92.8 %、98.4 %和94.5 %的ASCs中呈阳性(图5b),这与scRNA-seq数据分析的结果一致。
 
 
图5、血管平滑肌细胞免疫染色和流式细胞仪分析

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