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【新品速递】天昊生物推出微生物16S扩增子绝对定量测序服务



1.技术简介:
         16S rRNA基因扩增子高通量测序,是通过对基因组目的区域进行PCR扩增,将目标区域DNA扩增富集后进行高通量测序的研究策略,可有效研究特定环境中的物种信息,检测几十至几百种微生物特性。近来,特定环境样本中某一类群微生物的绝对定量问题受到越来越多研究学者的关注,以往都是通过特定物种的qPCR绝对定量进行检测,但qPCR定量实验结果常常不稳定,且特定物种qPCR需要设计特定引物,对引物特异性要求较高,且引物优化难度较大,导致常规的qPCR绝对定量实验不再适用于组成较为复杂的环境样本微生物绝对定量。目前,16S rRNA基因测序手段通过某一OTU分类单元的序列数占总序列数的比值来获得相对丰度数据,然而相对丰度信息不能反映环境样本中物种绝对丰度情况,而基于16S spike-in standards的微生物绝对定量测序恰好能够获得环境样本中物种的绝对丰度数据。
         该方法通过向样品DNA中添加一定量spike-in standards人工合 成序列,进行16S扩增子文库构建、测序,再根据spike-in standards 的16S扩增子reads数及其绝对拷贝数绘制标准曲线,计算出样品中OTU代表序列对应物种16S rRNA基因绝对拷贝数。添加16S spike-in standards到样品模板中进行16S rRNA基因扩增子高通量测序较好的解决了环境样本中微生物的绝对定量问题,同时也能得到环境样本中的物种组成信息。
        说明:由于该方法需要额外添加外源核算序列,且对样本的DNA要求也较高,因此目前阶段只适合做一些常规的环境样本 (常规土壤样本,人粪便样本)。
 
2.技术优势  
3.应用领域  
4.技术参数

 
5.技术路线


 
 
6.分析内容
  

 
7.服务流程


 
8. 结果展示
(1) 样本OTU代表序列对应物种16S rRNA基因绝对拷贝数计算
        (a)16S V4区扩增子测序的DNA模板中样品DNA和spike-in DNA添加情况

 
注: Y4_V4和Y42_V4是同一个样本分别添加2.67E+07 copies和2.67E+06 copies的spike-in DNA后的混合样本。
        (b)根据spike-in序列制作标准曲线(以Y4为例),计算优势OTU代表序列物种起始拷贝数:

表 1Y4_V4 样品中spike-in序列数及拷贝数
 

 
 
         (c)以log(copies)为横坐标,log(reads)为横坐标,制作标准曲线如下:


 
图 1 Y4样品的标准曲线
 
        (d)标准曲线如下根据标准曲线计算的测试样品中优势OTU序列(Top10)的起始拷贝数:

                 
        (e)根据各样品内部的标准曲线计算出各样本物种绝对拷贝数情况:
 

 
 
(2)spike-in的添加对样本原有群落组成影响不大
         以下是比较淤泥样本A三次测序结果,三次测序编号分别为A_V4(未添加spike-in序列)、Y42_V4(添加106 copies Spike-in序列)、Y4_V4(添加107 copies Spike-in序列)。
        a、同一样本添加不同拷贝数Spike-in standards测序物种相对丰度比较(genus水平):

表 3 三次测序属水平相对丰度统计表(优势物种相丰度大于0.1%)

 
 
 
        
         图4结果显示:Y4_V4、Y42_V4、A_V4样本优势菌属完全一致,且这些菌属在各个样本中的相对丰度比较一致,说明spike-in的添加对样本属水平的群落组成无明显影响,添加spike-in后的样本16 S测序结果也能反映样本本身群落组成情况。
比较Y4_V4、Y42_V4由各自内部标准曲线计算出的优势OTU代表序列拷贝数:
表 4 同一个样本不同标准曲线计算出的优势OTU代表序列的拷贝数情况
 
         比较两个样本计算出的优势OTU代表序列的拷贝数可得出以下结论:两个样本计算同一OTU代表序列拷贝数一致性较好,说明添加spike-in对样本中细菌进行绝对定量的方法重复性和稳定性均较好,能够真实定量出样本中各个物种的绝对丰度。
 
    



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