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基于下一代测序技术对痛风患者线粒体基因组分析
 


题目:基于下一代测序技术对痛风患者线粒体基因组分析
发表期刊:Arthritis Research & Therapy
发表时间:2018-7-6 影响因子:4.269

 
背景
       越来越多的证据表明,线粒体DNA(mtDNA)等位基因独立于核基因组,并且与疾病特别是是人类代谢疾病密切相关。然而,这一领域的研究与核等位基因的疾病方面相比仍落后很多,例如痛风等。
 
研究方法
       Illumina Hiseq和Ion Proton平台的线粒体基因组测序
 
研究内容及结果
       本研究利用下一代测序技术,对52名痛风男性患者和104名数据库中的非痛风样本对照的mtDNA等位基因和表型变异之间的关系进行研究,鉴定了与参考序列(GRCh38)之间的差异。序列核关联检验(SKAT)用于鉴定线粒体基因中痛风关联等位基因。综合运用基因分型、SIFT及预测病理突变(PMUT)、人类线粒体基因组数据库(mtDB)、多重比对(MAFFT)和哺乳动物线粒体tRNA基因(Mamit-tRNA)分析评估等位基因的致病性,并利用qPCR SNPs对潜在致病等位基因进行了验证。
 
 
 
图1、测序数据分析工作流的示意图。在与参考序列(GRCh38)进行比对后,记录痛风患者和非痛风对照中与参考序列(GRCh38)不同的822个等位基因(包括:蛋白质编码基因中的376个同义等位基因和160个非同义等位基因,tRNA基因中的52个等位基因,核糖体RNA ( rRNA )基因中的61个等位基因,以及非编码区中的173个等位基因)。步骤1:痛风患者和非痛风对照等位基因富集通过卡方检验/Fisher精确检验来鉴定。步骤2:计算基因负荷比,以将等位基因表征为正相关等位基因或负相关等位基因,用于序列核心关联检验(SKAT)分析。步骤3:从SKAT分析中获得了8个与痛风相关的基因,针对蛋白质编码基因中的等位基因进行Polyphen、SIFT和PMUT分析,针对tRNA基因中的等位基因进行mtDB、MAFFT和Mamit-tRNA)分析。步骤4:进一步验证所选等位基因的基因分型结果。步骤5:在功能注释后,选择蛋白质编码基因中的四个等位基因和tRNA基因中的四个等位基因进行基因型-表型关联。
 
表1、在痛风患者与非痛风对照中观察到的等位基因统计情况
 
 
 
 
 
图2、痛风患者tRNA基因中与线粒体正相关的等位基因。在痛风相关tRNA基因的所有阳性关联等位基因中,四个等位基因(m.5628 T > C,m.5783G > A,m.5814 T > C和m.15894G > A)破坏了碱基配对原则,被认为是潜在的致病等位基因。核苷酸之间的三级相互作用用虚线表示。箭头指示tRNA突变的位置。红色为潜在致病等位基因,绿色为非致病等位基因。
 
表2、SKAT分析鉴定的MT-CO3中正相关的等位基因
 
 
 
 
 
图3、用qPCR SNPs方法对m.5628 T > C 和m.9957 T > C的验证结果。
 
研究结论
       本研究在痛风患者中鉴定了456个等位基因,在非痛风对照中鉴定了640个等位基因,两者共有274个等位基因。线粒体基因与痛风相关的基因中,MT-CO3MT-TAMT-TCMT-TT含有可能致病的痛风相关等位基因,验证试验也证实了选定的等位基因的测序结果。通过基因型-表型关联发现,MT-CO3潜在致病等位基因与高密度脂蛋白(HDL)水平相关。
 
       本研究提供了与痛风相关的最详细的线粒体基因组图谱结果。本研究结果证实了线粒体基因差异在痛风和高密度脂蛋白中的作用,这一实验设计框架为其他涉及线粒体功能障碍的疾病研究提供参考。
 
 
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