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【昊阅读】宏基因组+宏转录组探究土壤中微生物的碳利用
夏季消耗、冬季休养:森林表层土壤中微生物的碳利用
 
英文题目:Feed in summer, rest in winter: microbial carbon utilization in forest topsoil
中文题目:夏季消耗、冬季休养:森林表层土壤中微生物的碳利用
期刊名:Microbiome       发表时间: 2017.9           影响因子: 8.496
样本信息:研究地点位于捷克波希米亚森林国家公园最高海拔,此处被挪威云杉所覆盖,共采集24份样本(六个生物学重复×两个季节×两个地点):分别在2012年7月(夏季)和2013年3月(冬季),在枯枝落叶层 (L)和土壤有机层(S)分别采集6个样本。去除根后,枯枝落叶层 (L)材料切成0.5厘米片段后混合,土壤有机层(S)经5mm网过滤后混合。
技术:
       宏转录组测序:Illumina HiSeq2000 PE150,约7-8G数据量/每个样本
       宏基因组测序:Illumina HiSeq2000 PE150,约7-8G数据量/每个样本
研究背景:
       常绿针叶林富含有机质,这些生态系统的枯枝落叶层 和土壤中发生了显著的碳转化,使它们对全球碳循环起着重要作用。由于对根系季节性的光合产物分配,表层土壤有效碳也随着季节更替而变化。本文的研究目的是描述C源利用的季节性差异以及在这一过程中土壤中各微生物成员的参与过程。
背景知识:CAZymes,碳水化合物活性酶,它对所有碳水化合物的合成、降解与修饰有非常重要作用,其包含6大类:糖苷水解酶(GH)、糖基转移酶(GT)、多糖裂解酶(PL)、糖类酯解酶(CE)、碳水化合物结合结构域(CBM)、辅助酶(AA)。深入了解碳水化合物活性酶,对于了解微生物碳水化合物的代谢机制非常重要。
研究结果:
辅助酶和糖苷水解酶相关基因的转录
        宏转录组数据的450万个contig中有13%归类为碳水化合物代谢,其中42872个(0.83%)转录本被鉴定为GH,5111(0.11%)个被鉴定为AA。GH的转录本在枯枝落叶层和土壤有机层的占比都在0.26-0.34%。AA的转录本在枯枝落叶层的比例(0.07–0.08%)要比在土壤有机层的比例(0.03–0.04%)较高(图1a)。
        GH和AA的转录本较多来源于真菌,较少来源于细菌:大部分GH和AA转录本被真菌转录,占GH序列数的51.6%(27.6%担子菌,19.3%子囊菌),占AA序列数的81.5%(子囊菌门44.7%,担子菌门35.1%)。细菌负责34.7%GH的转录(酸杆菌13.7%,变形菌7.6%)和13.1%AA的转录。GH也经常被动物(3.7%)和植物(2.6%)转录,而AA被植物转录占比3.3%(图1b,c)。

图1. 表层土壤中不同类群对转录本和基因库的贡献比例。A. AA和GH在宏转录组数据的占比。 B. 不同类群对GH转录的贡献。C. 不同类群对AA转录的贡献。LS:夏季枯枝落叶层,LW:冬季枯枝落叶层,SS:夏季土壤有机层,SW:冬季土壤有机层。
 
       很明显,不同生物群所产生的酶有很大的不同(图2b):所有类群都转录α葡萄糖苷酶和纤维素酶,然而真菌对纤维素酶和木质素降解酶的转录贡献度最高。所有物种都转录β-葡萄糖苷酶和几丁质酶,而古细菌不转录木聚糖酶,只有变形菌转录一些木聚糖酶。在植物中,大多数转录基因属于AA2(II类过氧化物酶),AA1(漆酶),GH27(α-半乳糖苷酶),和GH38(甘露)。

图2. 表层土壤中AA和GH的NMDS分析。A. 碳水化合物活性酶在不同季节土壤有机层和枯枝落叶层的宏转录组数据分析。B. 枯枝落叶层和土壤有机层中由较高生物类群转录的GH和AA池组成。 C. 碳水化合物活性酶在不同季节土壤有机层和枯枝落叶层的宏基因组数据分析。LS:夏季枯枝落叶层,LW:冬季枯枝落叶层,SS:夏季土壤有机层,SW:冬季土壤有机层。
 
        根据碳水化合物功能分类表,大部分宏转录组序列与GH13家族α-葡萄糖苷酶、GH5家族纤维素酶、GH7、AA9、木质素氧化酶AA3、内切葡聚糖酶GH16、几丁质酶GH18相关(图4)。

图4. 表层土壤中GH(糖苷水解酶类)和AA(辅助酶)家族被不同类群在转录和基因水平上的贡献比例。
 
        在纤维素降解基因中,AA9家族的转录本在枯枝落叶层中丰度很高(夏季27%,冬季40%),转录水平在枯枝落叶层和土壤有机层之间存在的明显差异反映了组间微生物群落组成以及碳源的差异,即土壤有机层中降解储备化合物(淀粉/糖原和海藻糖)相关碳水化合物活性酶的转录水平更高,而降解纤维素、木质素和果胶的相关酶在枯枝落叶层中则转录较多(图3),这表明植物来源聚合物是枯枝落叶层中最重要的C源,而细菌和根系分泌物是土壤有机层的主要C源。

图3. 表层土壤中GH(糖苷水解酶类)和AA(辅助酶)家族被不同类群的季节性转录。
 
 
转录的季节性
        枯枝落叶层和土壤有机层样品在夏季和冬季的转录水平都有所差异,这种季节性差异在土壤有机层中更为明显(图2a)。同样的各类群对碳水化合物活性酶转录水平贡献度也存在季节性差异,并且这种季节性差异在土壤中更为明显(图3)。
        冬季样本明显的特征就是储备化合物(糖原、淀粉和海藻糖)增多,同时针对纤维素和木质素的碳水化合物活性酶比例减少。针对真菌细胞壁成分(例如几丁质、葡聚糖)的碳水化合物活性酶转录水平在夏季明显比冬季高(图3),说明真菌在夏季较高的周转和生长速率。枯枝落叶层中细菌肽聚糖的相关降解酶转录水平也在夏季比冬季高。在冬季土壤有机层中由真菌转录的碳水化合物活性酶比例减少,而细菌的贡献则增加(图3)。
        在枯枝落叶层样本中,在2836个碳水化合物活性酶相关转录本中,219个(7.7%)在夏季明显增加,103(3.6%)个在冬季明显增加。在土壤有机层样本中,在2119个转录本中,287(13.5%)个在夏季明显增加,215(10.1%)个在冬季明显增加。这些结果表明土壤有机层中的转录本比枯枝落叶层中变化更为剧烈。在夏季土壤有机层中,比例较高的是针对纤维素、木质素和微生物细胞壁的碳水化合物活性酶,而针对淀粉、糖原和海藻糖的碳水化合物活性酶转录本则在冬季比例较高(图3)。
辅助酶和糖苷水解酶基因库
        宏基因组数据预测的基因中,有5.5%注释为碳水化合物活性酶。总的来说,土壤宏基因组数据共预测到来自108个家族的91195个GH和来自11个家族的7709 个AA。GH3是最多样化的家族,共有16,412个 contigs,其次是GH3和 GH15。宏基因组数据中丰度最高的家族分别是GH13、GH3、GH23(几丁质酶)、GH15、AA3、GH2(β-葡萄糖苷酶)、GH18(几丁质酶)、GH5、GH1(β-葡萄糖苷酶)(图4),这些家族大约占了总序列数的一半。
        在鉴定为GH的contigs中,有67%来源细菌,27%来源真菌。AA的contigs中,有46%来源细菌,24%来源真菌。考虑到发生的频率,GH序列的66.2%归类为细菌,序列的24.9%归类为真菌(图1b)。AA的序列中,61.8%归类为细菌,37.5%归类为真菌,归类为其它物种的序列则非常少(图1c)。基因库在枯枝           落叶层和土壤有机层之间差异显著,但季节间差异不大(图2c)。
总结:
       糖苷水解酶和辅助酶转录水平的季节性差异在土壤有机层中较枯枝落叶层更明显。
       编码相关酶(能降解淀粉或海藻糖)基因的转录水平在冬季土壤很高,而木质素和纤维素分解酶(主要由真菌产生)的转录水平在夏季则很高。
       真菌参与夏季生物聚合物的分解,而细菌在冬天取代它的这个角色。
 
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