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LncRNA研究,像这个夏天一样“火热异常”
        2017年的夏天,比以往热得更猛一些。在这高温天气里,LncRNA研究也是“火热异常”,不同档次的研究杂志发个不停!来杯加冰可乐,切个冰镇西瓜,和小编一同感受最新lncRNA文章的热度吧。
文献案例1: 小鼠肝脏富集lnc-LFAR1通过激活TGFβ和Notch通路促进肝纤维化发生
(The liver-enriched lnc-LFAR1 promotes liver fibrosis by activating TGFβ and Notch pathways)
期刊名:Nature Communications      发表时间: 2017年7月    影响因子: 12.124
研究背景: 肝纤维化是一种肝脏内细胞间质(ECM)成分的病理性积累过程,可由持续性肝损伤导致,重要原因是肝星状细胞(HSCs)的激活促进了ECM蛋白的合成,以及损伤引起的肝实质细胞(HCs)的细胞凋亡,因此失活和抑制这些过程便成为肝纤维化的治疗策略。
科学问题: LncRNA在肝纤维化过程中是否具有生物学功能?是如何起作用的?
实验材料:
        实验所用细胞株
        采用非致瘤的小鼠HC细胞系AML12和HEK293T细胞。
        小鼠模型
        肝纤维化小鼠模型采用Balb/c雄性小鼠进行,具体方法如下图:

 
 
HSCs和HCs的分离和培养

 
 
高通量测序测定

 
 
研究结果:
肝纤维化小鼠模型lncRNA表达谱分析


 
图1、诱导肝纤维化小鼠模型的建立及lncRNA表达谱测定
 
        文章首先通过组织染色及免疫组化技术,确定了肝纤维化小鼠模型诱导方法可行。然后对CCl4处理和不处理的 Balb/c小鼠进行基因芯片测定,聚类分析发现,lncRNA的表达确实存在明显的差别(图1-d)。
目标lncRNA — lnc-LFAR1的锁定
        如何对获得的大量表达差异基因进行筛选,直接关系到后续研究方向与实验成败,也一直是研究人员头疼和纠结的地方。本文作者首先通过基因芯片结果选取lncRNA表达量变化及与mRNA共表达网络选取了10个lncRNA,RT-PCR验证了NONMMUT013861等10个lncRNA表达变化与芯片结果相符(图1-e)。之后研究者有目的的寻找能够在肝脏组织中富集表达的lncRNA,并且在细胞质和细胞核中都表达。最终幸运的从这10个lncRNA中锁定了lnc-LFAR1(图2)。
 
图2、Lnc-LFAR1能够在肝脏组织中富集表达
 
Lnc-LFAR1调控HSCs中的ECM基因表达
        在确定了后续研究围绕lnc-LFAR1展开后,研究者展开了一系列探讨lnc-LFAR1生物学功能实验。通过RACE实验获得lnc-LFAR1全长,利用AML12细胞内的瞬时转化实验证明它唯一的外显子不具有编码蛋白能力,同时检测了肝纤维化过程中lnc-LFAR1的表达情况。那么lnc-LFAR1在HSCs的活化过程中有起了什么作用呢?于是研究者在初级HSCs中敲降了lnc-LFAR1,之后利用高通量测序技术进行了RNA-seq测定,分析mRNA的变化情况,寻找可能的靶基因(图3)。

 
图3、lnc-LFAR1敲降后HSCs中mRNA表达变化情况
 
        通过差异表达基因、GO和KEGG分析后发现在HSCs中敲降lnc-LFAR1后同样使得TGFβ诱导上调的纤维化相关基因表达急剧减少。
Lnc-LFAR1 沉默抑制CCl4和BDL诱导的小鼠肝纤维化

 
图4、CCl4和BDL诱导的沉默Lnc-LFAR1小鼠mRNA表达变化情况
 
        研究人员再次在CCl4和BDL诱导的小鼠中沉默Lnc-LFAR1,然后用基因芯片检测了mRNA的表达变化情况(图4)。同样的对差异表达基因、GO和KEGG分析后发现Lnc-LFAR1沉默影响了TGFβ受体信号途径相关基因的表达。
后续机制研究
        研究者随后通过实验进一步证明了TGFβ下游的Smad2/3,可以通过直接与lnc-LFAR1启动子区结合来增强它的表达。同时,lnc-LFAR1又可以促进Smad2/3的表达和磷酸化。研究者还检测了其他可能的信号途径,发现lnc-LFAR1 还可以通过激活Notch 途径来促进肝纤维化。最终研究者提出了一个模型,解释了可能的调控机制(图5)。
 
 
图5、Lnc-LFAR1在肝纤维化过程中可能的作用机制
 
文章点评:
        本研究在结构上还是比较系统完整的,无论是从前期关键lncRNA分子的筛选,到后期各种细胞和小鼠肝纤维模型实验,再到如何与下游关键因子相互作用的分子机制研究,实验相互印证,环环相扣,不失为lncRNA研究中的上乘之作。
 
文献案例2:蛛网膜下腔出血早期大脑损伤下的高通量测序及lncRNAs和mRNAs共表达网络分析
(High-Throughput Sequencing and Co-Expression Network Analysis of lncRNAs and mRNAs in Early Brain Injury Following Experimental Subarachnoid Haemorrhage)
期刊名:Scientific Reports      发表时间: 2017年4月    影响因子: 4.259
研究背景: 蛛网膜下腔出血(SAH)是脑动脉瘤破裂后致命的神经血管疾病,其发病率和死亡率都较高。LncRNAs可以在哺乳动物大脑中大量表达,参与调控了很多神经系统疾病的发生。然而,目前很少有关于lncRNA在蛛网膜下腔出血的早期脑损伤的(EBI)影响报道。本研究目的就是通过高通量测序技术寻找两者之间的关系。
实验材料:
动物材料
成年雄性C57BL / 6J小鼠(8 - 12周)。
RNA-seq材料及流程


 
 
研究结果:
小鼠SAH诱导模型及RNA-seq质控
 
图1、小鼠SAH诱导模型组织图片及RNA-seq质控结果
 
lncRNAs 和 mRNAs差异表达情况

 
图2、SAH和对照组序列比对图
 
 
图3、SAH和对照组差异表达基因情况
 
图4、GO和KEGG分析
 
图5、差异表达LncRNA和mRNA共表达网络及在Toll-like 受体信号通路变化
 
         以上的结果都是常见的分析内容,通过对SAH和对照组的RNA-seq结果分析,发现了一些变化的候选lncRNA和mRNA。结合前人报道,本文选择了lncRNA fantom3_F730004F19进行后续实验,包括利用RNA FISH染色,检测它的亚细胞定位、RT-PCR验证RNA-seq结果。之后在BV-2细胞中敲降lncRNA fantom3_F730004F19导致CD14和 TLR4表达降低,探讨了它减弱炎症细胞的潜在功能。
文章点评:
        本研究较为系统的展示了SAH诱导的RNA-seq结果,但是基于后续lncRNA的功能实验较少,没有过多涉及到分子机制研究,因此较第一篇文章就稍逊一筹。
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