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靶向捕获测序在进化及生态学中的应用
        高通量测序技术的迅速发展,已经成功解决了一些数年前难以想象的生物学问题。靶向捕获测序是对感兴趣的基因组区域预先扩增和富集,然后进行建库测序的一种技术策略,可以通过基于PCR的捕获或者基于固相和液相捕获探针组等方法实现。鉴于该策略在技术上的优点和可行性,靶向捕获测序在生物进化和生态学研究中的应用已经越来越广泛。
        虽然目前测序成本不断降低,测序通量逐渐增大,但是由于不同物种基因组大小和复杂性的不同,靶向捕获测序在某些物种基因组学及功能研究中仍是最优策略。以高比例重复序列为特征的大基因组(例如火炬松基因组22 Gb,重复序列约占83%),这些重复序列会对我们关心目标区域造成干扰,需要靶向捕获来优选以避免这些重复区域,聚焦基因组序列中的目标功能区域。为此,靶向捕获广泛应用于具有多倍体基因组和转座子丰度物种的蛋白质编码变异检测,完成全基因组测序无法解决的物种基因组研究。
        靶向捕获主要应用于蛋白质编码外显子区域,但是对于调节区域如UTR、miRNA、启动子区域和其它非编码元件,只要序列GC含量适中,同样可以进行。此外,还可以利用目标基因位点的覆盖均匀性来基于相对覆盖度推断拷贝数变化。在这方面使用靶向捕获是一个巨大的优势,因为结构变异(例如全基因组或基因复制和染色体重排)可以在适应和物种形成中发挥重要作用。当然,由于文库制备或杂交过程中引入的偏差可能导致CNV的不准确,需要在后期根据实际情况予以校正。
无参考基因组的靶向捕获测序
        靶向捕获方法的实施需要以目标基因区段的序列已知为前提。因此,首要问题是获得用于捕获探针设计的目标基因区段序列。对于有参基因组的物种来说,数据库信息相对完备,靶向捕获的探针设计、文库制备以及生物信息学会容易很多,这里就不展开讨论了。
        对于生物进化及生态学领域中涉及的无参考基因组的物种还有很多。于是,人们针对无参考基因组或非模式物种,通过de novo测序组装策略来获得靶向捕获需要的序列信息,这些方法理论上可以应用于任何物种。例如,可以使用de novo RNA-seq或表达序列标签( EST )数据来设计对应于外显子区域的探针。这里存在的一个技术挑战在于对外显子边界的识别,因为跨越外显子边界的探针捕获将造成目标区域的低覆盖度和较低的总体捕获性能。外显子边界往往是保守的,并且通常可以通过与其它不同物种参考基因组的注释比较来识别。此外,也可以对低覆盖度全基因组测序(LC-WGS)测序序列进行de novo组装,然后根据目标区域序列设计探针进行靶向捕获。LC-WGS数据也可以与近缘物种参考基因组比对,识别用于捕获的保守外显子区域。
        基于de novo组装的靶向捕获方法为了降低成本,通常需要进行两次测序实验,首先是针对有代表性的小量样本的测序。例如,RNA-seq可以来自单个个体,然后进行后期的进化和生态规模大样本的靶向捕获测序。
何时采用靶向捕获测序?
        目前没有一个放之四海而皆准的测序策略能够解决所有生物学问题,需要根据具体的研究内容及目标进行调整。靶向捕获测序可以应用于生物进化和生态研究的几个活跃领域包括:
• 表型性状的遗传作图
        遗传作图仍然是鉴定表型进化的遗传机制的主要方法之一。通过杂交或关联研究的QTL作图需要有遗传图谱信息。然而,作图研究很少可以达到单个基因或标记分辨率。在这些情况下,靶向捕获测序可用于将未知遗传变异信息锚定到已知基因或其它功能元件上,从而真正寻找到关键变异位点。
• 检测基因组中的选择
        自然选择是控制进化变化的重要方面。基因组测序技术可以让人们了解不同生物体基因组中选择频率、模式和分布情况。然而目前评估大规模选择模式所需的数据主要来自于参考基因组完备的类群。因此为了加深我们对形成遗传多样性的进化过程的理解,需要将这些研究扩展到不同的自然群体。对目标外显子、侧翼内含子、上下游调控序列的长连续区域或甚至非编码基因间区域上的大片区域的检测,可以提供强大的选择性扫描,估计选择性扫描强度和基因组变化速率的能力。
• 系统发生学研究
        靶向捕获测序的灵活性为系统发生学研究提供了巨大的优势技术。定制的捕获设计可以针对数百或数千个位点,以解决一系列系统发育问题。为了最大化系统发育信息,选择进化速率适合于解决给定关系的基因座非常重要。例如,深层系统发育节点是通过进化缓慢的序列来解析的,这些序列在遥远的分类群中保留了正交信号。基于简化基因组方法得到的基因组数据进行的系统发育推断,其大部分低于属水平。靶向捕获测序能够捕获缓慢进化的超保守元件标记物,已成为解决脊椎动物系统发育中深层节点的一种非常有前景的方法。此外,靶向捕获测序可以来解决群体遗传的有效性问题,例如有效群体大小、基因流动、系统地理学等。
• 古代DNA与宏基因组学的应用
        从古生物遗骸、沉积物和博物馆标本中提取的古代或历史DNA (aDNA )可以提供对谱系进化历史的证据。处理古生物学样品中的aDNA样品的一个挑战是从细菌DNA和靶DNA的复杂混合物中分离感兴趣的序列。例如,约55000年的人骨碎片的残余物中约99 %的污染环境DNA组成。通过设计捕获特定靶序列的探针,可以大大减少了大量污染物DNA测序的问题。目前,从环境样品中分离和测序DNA(宏基因组学)以研究病原体进化或微生物群落组成也是一个热门领域。此外,靶向捕获可以提供高通量的方法来对物种条形码进行检测,分析群落组成,探索群落中的功能变化,例如靶向检测特定生态功能下的基因等。
 
• 参考文献
        1. Targeted capture in evolutionary and ecological genomics. Molecular Ecology, 2016
        2. From genomes to GENE-omes exome sequencing concept and applications in crop Improvement. Frontiers in Plant Science, 2017
关于天昊
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