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技术服务

全转录组测序

全转录组测序

技术简介:

      全转录组(whole transcriptome)是指特定物种、组织或细胞类型在某个时期或条件处理下,能转录出来的所有RNA(转录本)的总和,包括mRNA和非编码RNA(ncRNA)。目前所说的全转录组测序,主要检测了mRNA和三种ncRNA,即lncRNA、circRNA和miRNA。

技术优势:


     • rRNA去除建库,保留了完整的RNA种类信息;
     • 链特异性文库,可以保留转录本的链信息,更准确地检测反义RNA;
     • 使用高通量测序,能够获得更加全面的RNA信息,包括低丰度的RNA;
     • 通过测定的序列信息精确地分析不同类型RNA的表达丰度变化及其生物学功能;
     • 整合分析同一样本中的多种类型RNA,明确这些RNA之间的共表达和调控关系;

应用领域:


     •  临床样本的全转录组检测,应用于疾病研究和个体化医疗;
     •  多组学研究,深入挖掘转录水平的调控作用及生物学意义;

技术参数与实验流程


技术参数


样品要求 测序策略 数据要求
  • • 样品类型:完整无基因组DNA污染的Total RNA;
  • • 样品需求量(单次):总量>4μg,浓度>100ng/μL;
  • • 样品纯度:OD260/280 ≥ 1.8,28S/18S ≥ 1.5,
  • • 样品完整度:Agilent 2100 Bioanalyzer RIN值 ≥ 7.0;
  • • 样品无明显降解;
  • • Illumina HiSeq 2500或Illumina HiSeq X Ten;
  • • rRNA去除的链特异性文库:2×150bp;
  • • 小RNA文库:1×50bp;
  • • rRNA去除的链特异性文库:至少12G clean data;
  • • 小RNA文库:5~10M clean reads;

实验流程


A. 全转录组建库测序流程


图1 rRNA去除的链特异性文库

图2 小RNA文库

B. 数据分析流程


图3 rRNA去除的链特异性RNA-seq标准分析

图4 小RNA-seq标准分析

图5 联合分析示意图

经典文章解读


案例:RNA–miRNA–circRNA整合分析揭示苯并[a]芘(BaP)致癌作用机制

背景:

       虽然前人通过动物模型研究了化学致癌物质苯并[a]芘(BaP)的致病机理,但是研究结论争议很大,另外,对于BaP致癌的作用机理研究很少。因此,作者通过转录组层面的全面探究,整合分析了mRNA、circRNA、miRNA的动态变化,从而更深入地研究BaP诱导细胞致癌的机理。

方法:

      选取BaP处理(对照处理采用DMSO)后6个时间点(6h、12h、18h、24h、36h、48h)的人类HepG2细胞进行全转录组测序(其中每份样品2个生物学重复,分别进行Ribo-depleted RNA测序和Small RNA测序,测序平台为Illumina HiSeq 2000,测序长度均为2x100bp)。通过差异表达分析、时间序列分析、不同类型转录本间相互作用分析,探究BaP致癌过程中的竞争性调控机制。

结果:

       1. BaP处理对转录本(包括mRNA、miRNA、circRNA)的表达影响
      首先,发现了一些新转录本和可变剪切是由BaP刺激产生,尤其是一些参与DNA损伤反应和凋亡的基因,如TP53、BCL2、XPA,另外,BaP处理导致了DNA修复相关的基因表达下调。同时还识别了一些circRNA,鉴定出差异表达的circRNA和miRNA(其中miR-181家族和miR-19家族已被证实与致癌相关)。

表1 BaP处理后差异表达RNA、miRNA、circRNA数目统计

      然后,STEM时间序列分析显示只有CYP1A1(细胞色素P450)基因和miR-181a-1_3P在6个时间点始终过表达,并且CYP1A1和miR-181a-1_3P随着时间变化一直下调表达;而circRNA尽管在不同时间点呈现差异表达,但在整个BaP处理过程中并未检测到一致性变化趋势。

图1 BaP处理后CYP1A1和miR-181a-1_3P的表达变化情况

       2. 整合分析miR-181a-1_3P、DNA修复相关的基因、circRNA
      发现14个差异表达mRNA和16个差异表达circRNA都具有miR-181a-1_3P的作用位点,其中差异表达的MGMT已有报道其减耗可能会增加致癌风险。

表2 具有miR-181a-1_3P作用位点的差异表达mRNA

      miR-181a-1_3P、MGMT和circRNA的表达随着时间变化,并且变化趋势具有一定的相关性。

图2 BaP处理后MGMT的表达变化情况

图3 BaP处理后16个差异表达circRNA的表达变化情况

       3.BaP处理HepG2细胞过程中miR-181a-1_3P、MGMT和circRNA的竞争性调控机制

图4 BaP致癌作用机制模型

参考文献:

      CAIMENT F, GAJ S, CLAESSEN S, et al. High-throughput data integration of RNA-miRNA-circRNA reveals novel insights into mechanisms of benzo[a]pyrene-induced carcinogenicity. Nucleic acids research, 2015, Vol.43(5): 2525-2534.

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