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技术服务

mRNA-seq

mRNA-seq

技术简介:

       mRNA虽然只占细胞总RNA的3%左右,但由于其最终翻译成蛋白质,参与人类生长、发育、疾病发生发展等一系列的生物学过程,一直是研究的焦点。mRNA高通量测序(mRNA-seq)是利用高通量测序技术,对特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的全部mRNA进行测序,全面快速得到基因表达谱变化的同时,还可以通过序列信息精确地分析转录本的cSNP、可变剪切等序列及结构变异,另外对于检测低丰度转录本和发现新转录本具有其独特的优势。

技术优势:


     • 开放的全转录组分析:无需预先设计探针,直接对进行最全面的转录组分析;
     • 准确性高:数字化信号,直接测定每个转录本片段的序列;
     • 检测阈值宽:跨越6个数量级的宽检测阈值,能同时鉴定及定量正常和稀有的转录本;
     • 分辨率高:可以检测基因家族中相似基因及可变剪接造成的单碱基差异;
     • 信息量大:除表达量外,还提供转录本的边界鉴定、RNA编辑、可变剪切、基因融合等信息。

应用领域:


     • 快速鉴定不同物种、不同组织、不同发育阶段、不同疾病状态下已知和未知的mRNA及其表达差异
     • mRNA编辑分析
     • 发现融合基因;新的mRNA可变剪切;lncRNA分析

技术参数与实验流程


技术参数


样本要求 mRNA富集方法 测量平台 测量数据量
  • a) 样本类型:完整无DNA污染的Total RNA;
  • b) 样本起始量 (单次):≥ 2 μg /样本;
  • c) 样本浓度:建议≥ 50 ng/μL;
  • d) 样本纯度:OD260/280 ≥ 1.8;
    28S/18S ≥ 1.5;
  • e) 样本完整度:Agilent 2100 Bioanalyzer
    RIN值 ≥ 8.0
  • PolyA富集或者去除核糖体RNA法
  • Illumina®Hiseq2000 2X150bp测序
  • 每个样本测序数据3G/5G/10G;
    rRNA比例低于rawdata 的3%

试验流程


      建库测序流程


数据分析内容


mRNA-seq生物信息分析内容
标准分析 高级分析
原始数据整理、过滤及质量评估 cSNP分析(需达到10G数据量)
参考基因组注释信息整理 新转录本预测(需达到10G数据量)
比对到参考基因组及结果评估 可变剪切分析(需达到10G数据量)
基因表达量统计 融合基因分析(需达到10G数据量)
表达差异基因分析 LncRNA分析(需达到10G数据量)
表达差异基因 GO/KEGG 富集分析 个性化分析

经典文章解读

研究背景:

      临床上对于脑溢血(intracerebral hemorrhage,ICH)和缺血性卒中(ischemic stroke,IS)的病人,当病人情况比较危急无法进行影像学检查时,是很难进行区分的。因此,准确、便宜、快速的血检是对于临床检测的有效补充。已有文章报道了卒中病人血液转录组表达量的变化可以作为临床检测的biomarker,并进一步阐述了卒中病人血液转录组调节免疫应答的机制,但不同剪切本在卒中病人中的情况并不清楚。

材料与方法:

材料:

      为了更精准的实验设计,本文只选取了白人男性。心源性脑卒中(Cardioembolic IS)、大血管卒中(large vessel)、腔隙性卒中(lacunar)、脑溢血(ICH)病人及正常人对照组各4例,共20例。(表1)

方法:

      转录组测序,只关注不同剪切本。

结果:

       1、412个基因在五组病人/对照组全血样品转录组中存在不同的剪切本(differential alternative splicing,DAS),这些基因参与了细胞免疫、细胞因子、细胞死亡、存活等信号通路。
       2、由于不同剪切本主要是在剪切过程中选择不同外显子造成的,进一步分析发现,292个基因的308个外显子在五组病人/对照组中的表达量存在差异。
       3、根据不同外显子的表达情况,可将五组病人/对照组划分开:(图1)

             • 心源性脑卒中(Cardioembolic IS)相关剪切本集中在离子结合/转运和细胞结构通路中;              • 大血管卒中(large vessel)相关剪切本集中在细胞死亡、转录、核染色质重塑通路中;              • 腔隙性卒中(lacunar)相关剪切本集中在细胞应激、循环、死亡、生存通路中;              • 脑溢血(ICH)病人相关剪切本集中在蛋白转运和定位通路中。

参考文献:

      Dykstra-Aiello C, Jickling G C, Ander B P, et al. Intracerebral hemorrhage and ischemic stroke of different etiologies have distinct alternatively spliced mRNA profiles in the blood: a pilot RNA-Seq study[J]. Translational stroke research, 2015, 6(4): 284-289.


表一

表二

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