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技术服务

microRNA测序

microRNA测序

技术简介:

       miRNA (microRNA) 是一种大小约21-23个碱基的单链小RNA,miRNA通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻译,从而在转录后水平调控蛋白表达。基于Illumina HiSeq高通量测序技术的miRNA-seq,可以一次获得数百万条miRNA序列,能够快速鉴定出不同组织、不同发育阶段、不同疾病状态下已知和未知的miRNA及其表达差异,为研究miRNA对细胞进程的作用及其生物学影响提供了有力工具。

应用领域:


     • 快速鉴定不同物种、不同组织、不同发育阶段、不同疾病状态下已知和未知的microRNA及其表达差异
     • microRNA编辑、microRNA异构体检测、新microRNA预测及microRNA靶基因分析

技术优势:


     • 通量高:一次测序得到500万条以上的序列;
     • 分辨率高:可以检测小 RNA单个碱基的差异;
     •  精准度高:从几个到数十万个拷贝精确计数;
     • 不依赖已知信息:既能鉴定已知miRNA,又能发现新miRNA;
     • 可重复性高:深度测序保证了抽样随机性,重复性非常好,无需重复实验。

技术参数与实验流程


技术参数


样本要求 文库类型 测序策略
  • Total RNA,总量>2ug,浓度≥200 ng/μL;
  • RNA无明显降解 (28S:18S>1.8;RIN>7)
Small RNA文库
  • Hiseq SE50;
  • 单个样本6-10M clean reads

实验流程



数据分析流程



经典文章解读

【肿瘤】MiRNA测序解析存在治疗响应差异的不同亚型弥漫大B细胞淋巴瘤miRNA组学差异

研究背景:

       弥漫性大B细胞淋巴瘤 (Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL) 是一类侵袭性疾病,是最常见的成人非霍奇金恶性淋巴瘤(NHL),根据其不同的细胞来源和对化疗的响应的不同可以分为活化B细胞样 (ABC) 和生发中心B细胞样(GCB)两种亚型,其中ABC亚型的病人(30~40%)在现有的初期治疗中失败。

研究目的:

      为研究DLBCL的miRNAome,从miRNA水平开发新的生物标记和治疗目标,对NHL的临床管理有重要作用。

研究方法:

     • 92 例DLBCL患者(30 ABC-DLBCL, 41 GCB-DLBCL, 和21 unclassified-DLBCL ) 和15例早期中心母细胞淋巴瘤的新鲜冰冻样品进行miRNA-seq,筛选差异miRNA和发现新miRNA。

     • 140 例独立的DLBCL 甲醛固定、石蜡包埋(FFPET)组织样本的miRNA-seq数据验证生存分析。

     • 新miRNA的qPCR验证和候选miRNA双荧光素酶验证。

研究结果:



图1 表达谱聚类分析图

      1. miRNA-seq在92例DLBCL 和15例中心母细胞样本中发现310个已知miRNA。同时鉴定了234个候选的novel miRNAs,其中30个高表达miRNA进行后续分析,表达图谱见图1b,同时在7,266个TCGA的miRNA-seq 样品库中分析这些miRNA的表达量,发现3个miRNAs (NOVELM00260M, NOVELM00010M和miR-10398-3p) 在B细胞显著富集。

      2. 差异分析结果中63个miRNA在DLBCL中高表达,39个低表达,同时也利用TCGA的数据集分析了B细胞和其它癌症中差异表达的miRNA。另外,也分析了可以区分不同亚型DLBCL的差异miRNA,其中23个在ABC-DLBCL亚型中高表达,30个在GCB-DLBCL亚型中高表达。


图2 DLBCL中候选miRNA:mRNA的相互作用

      3. 同时测定这些样本的mRNA表达谱,找到候选的miRNA:mRNA调控互作,并进行GO分析,结果发现与在DLBCL中高表达miRNA相互作用的mRNA主要富集在cell cycle, metabolic processes, chromatin modification, protein modification, nerve growth factor signaling pathway和organelle organizaion相关的通路中(图2)。


图3. NMF分析鉴定两类DLBCL 患者有着不同的miRNA表达和 outcome特征.

      4. 分析这些miRNA与癌症患者的总生存期和无进展生存期的关系,发现58个和45个miRNA分别与OS和PFS相关,进一步进行Cox比例风险多变量分析,确定25个miRNA独立于IPI和COO与OS、PFS相关。同样在FFPET 组织活检的验证组样本中验证了部分在发现组发现的一些相关miRNA。

      5. 为进一步确定DLBCL患者是否可以通过其miRNA的表达量进行分层,通过无监督的非负矩阵分解(NMF)共识聚类对83例R-CHOP处理患者的miRNA表达量进行分析,可以鉴定出两类患者 (图3),他们有着不同的outcome相关性和miRNA表达谱。

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