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技术服务

mRNA/miRNA/LncRNA/circRNA荧光定量服务说明

mRNA/miRNA/LncRNA/circRNA荧光定量技术介绍

技术简介:

       miRNA (microRNA) 是一种大小约21-23个碱基的单链小RNA,miRNA通过和目的基因mRNA碱基配对引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻译,从而在转录后水平调控蛋白表达。LncRNA(Long noncoding RNA)是一类200nt以上,不编码蛋白的长链非编码RNA,参与细胞多个生物学过程的调控;circRNA是一类自身成环的环状RNA,在不同物种中起到miRNA海绵的作用,也被称为竞争性內源RNA(ceRNA),能竞争性结合miRNA,从而调控目的基因的表达。这几类RNA作为非编码RNA在真核生物内普遍存在,并且具有组织和不同发育阶段的表达特异性。

      荧光定量PCR(Realtime fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)是一种利用Total RNA逆转录得到的一链cDNA为模板,在PCR反应扩增的同时实时检测产物荧光信号作为指标的定量检测技术,具有灵敏度高,特异性好,结果准确可靠等特点。检测中采用SYBR Green染料法/探针法进行RT-qPCR相对定量,用已知管家基因做为内参照,根据目的基因和管家基因的相对表达作为定量的最后结果。

技术优势:

     •  灵敏度高:拷贝数低的基因也能检测;
     •  特异性好:特异性引物结合与双链特意结合的SYBR染料,保证检测的特异性;
     •  通量大:检测位点灵活可变,多至384个点同时检测;
     •  精准度高:扩增和检测在同一管,不易污染;平行设置3个重复,减少系统误差。

应用领域:

     •  基因表达差异分析:比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异 (如药物处理、物理处理、化学处理等),特定基因在不同时相的表达差异等;
     •  表达芯片/二代测序的差异结果验证;
     •  RNAi效果确认 (siRNA的筛选)。

技术参数:



实验流程:



经典案例解读

案例1:用乙醇处理中国甜柿果实转录组分析

背景:

柿子是一个重要的商业和落叶果树。果实的原花青素(PA)含量占干重百分比超过25%,因此口感很涩。原花青素引起的涩味,往往不容易被人接受,因此,除去涩味在柿子产业变得十分重要。把柿子放在含有稀乙醇的聚乙烯袋子中可以将可溶性的原花青素转换为不可溶性的原花青素。由于其庞大而复杂的基因组,柿子基因组资源的开发被推迟了。

方法:

     •  收集处理和不处理样本, 5%乙醇处理的柿子和不含5%乙醇处理的柿子
     •  进行mRNA-seq
     •  Unigenes的 GO分析,KEGG分析
     •  确定处理和不处理样本中的差异表达基因
     •  qPCR验证转录组数据得到的差异表达基因是否准确

结果:

1.鉴定到83898个unigene (平均长度1155bp),其中54,719 (65.2%) unigenes被注释。

2.24,337 unigenes可以被GO term 分类,其中参加代谢过程的基因数目最多。

3.KEGG分析发现,参与糖代谢,氨基酸代谢等代谢生物过程的基因同样最多。在第二级代谢分类中,苯丙烷类生物合成基因数目最多。

4.通过比较乙醇处理和不处理样品的转录组数据发现3639 个基因表达差异明显( 在处理样品中1560 个基因表达上调,2079个基因表达下调)。 通过对原花青素合成基因和单宁酸凝固相关基因的QPCR实验验证,证明转录组数据是准确的。

参考文献:Chun Luo et al. Genome-wide transcriptome analysis of Chinese pollination-constant nonastringent persimmon fruit treated with ethanol. [J]. BMC Genomics. 2014 Feb 8;15:112. doi: 10.1186/1471-2164-15-112.

案例2:山羊地方动物性鼻腺癌新的和差异表达miRNAs鉴定

背景:

miRNAs在涉及真核细胞生长、发育、代谢等多种基因的转录后调节,以及参与癌症的启动和进程中起着非常重要的作用。地方动物性鼻腺癌(ENA)是由地方性鼻肿瘤病毒(ENTV)引起的山羊和绵羊的上皮肿瘤,是一种慢性、渐进性、接触传播的疾病。

方法:

     •  用ENTV病毒侵染的山羊,收集癌和癌旁组织
     •  上机测序
     •  确定ENA中差异表达miRNAs鉴定
     •  对差异表达miRNAs基因的功能分析
     •  qPCR验证所得差异表达基因是否准确

结果:

5.测序获得癌和癌旁组织的clean reads和unique reads统计

6.鉴定到435个miRNA,其中116个miRNA在癌和癌旁组织中表达显著差异。

7.对样品中表达差异miRNA的GO分析发现,有1792个GO分类得到显著性富集,主要参与转移酶活性,质膜及血管发育等代谢生物过程的基因等。

8.通过比较山羊ENA癌和癌旁的差异表达miRNA的KEGG分析发现,267个KEGG得到富集,其中97个有显著差异(P<=0.05),主要涉及了肿瘤免疫系统信号转导等。

9.通过对在GO和KEGG分析中有代表性的5个miRNAs和两个新发现的miRNAs的表达进行qPCR实验验证,证明测序数据是准确的。

参考文献:Wang Bin et al. Identification of novel and differentially expressed MicroRNAs in goat enzootic nasal adenocarcinoma. [J]. BMC Genomics. 2016 17:896. doi: 10.1186/s12864-016-3238-5.

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