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微生物16S扩增子绝对定量测序

微生物16S扩增子绝对定量测序

服务介绍:

    16S rRNA基因扩增子高通量测序,是通过对基因组目的区域进行PCR扩增,将目标区域DNA扩增富集后进行高通量测序的研究策略,可有效研究特定环境中的物种信息,检测几十至几百种微生物特性。近来,特定环境样本中某一类群微生物的绝对定量问题受到越来越多研究学者的关注,以往都是通过特定物种的qPCR绝对定量进行检测,但qPCR定量实验结果常常不稳定,且特定物种qPCR需要设计特定引物,对引物特异性要求较高,且引物优化难度较大,导致常规的qPCR绝对定量实验不再适用于组成较为复杂的环境样本微生物绝对定量。目前,16S rRNA基因测序手段通过某一OTU分类单元的序列数占总序列数的比值来获得相对丰度数据,然而相对丰度信息不能反映环境样本中物种绝对丰度情况。
    而基于16S 外标序列的微生物绝对定量测序恰好能够获得样本中物种的绝对丰度数据。该方法通过向样品DNA中添加一定量外标序列,进行16S扩增子文库构建、测序,再根据外标序列的16S扩增子reads数及其绝对拷贝数绘制标准曲线,计算出样品中OTU代表序列对应物种16S rRNA基因绝对拷贝数。该方法是一种将qPCR绝对定量技术和常规16S扩增子测序技术合二为一的技术,该技术不但可以进行Alpha多样性分析、群落组成分析、Beta多样性分析和环境因子分析等常规扩增子测序分析,而且可以解析样本中总细菌和特定菌种的绝对拷贝数,该技术充分发挥了“常规16S扩增子测序(细菌群落结构)+qPCR(细菌绝对拷贝数)” 两种检测技术的各自优势,变‘两张皮’为‘一盘棋’, 最大限度地便利了广大微生态研究者。

技术参数及分析内容


技术优势:


  • 数据量大:不低于15万reads/样品,可检测环境微生物群落中的痕量菌,以及发现新的微生物。
  • 方案经济便捷:单个16S扩增子测序可同时获得样本中微生物的组成信息和绝对定量数据。
  • 适用范围广:可同时得到样本中绝大多数优势物种的绝对定量数据,该方法具有普遍适用性。
  • 真实、准确:绝对定量数据,测序结果真实,客观还原菌群结构及丰度比例,无样品偏差可直接比较。

技术参数


分析流程


经典案例解读

项目文章:高通量微生物绝对定量测序揭示不同施肥应用对种植番茄的滨海盐渍土壤细菌群落的影响

英文题目:High-throughput absolute quantification sequencing reveals the effect of different fertilizer applications on bacterial community in a tomato cultivated coastal saline soil

中文题目:高通量微生物绝对定量测序揭示不同施肥应用对种植番茄的滨海盐渍土壤细菌群落的影响

期刊名:Science of the Total Environment

影响因子: 5.589

研究背景:

    盐渍土在世界范围内广泛分布,占地球表面的8%。我国盐渍土总面积为3.67×107ha,其中30%具有农业利用价值。滨海盐渍土是盐渍土的一个亚类,是江苏省重要的潜在土地资源。中国沿海总面积2.17×106ha,其中95%为潮间带,江苏约占1/4。此外,由于黄河和长江的大量泥沙淤积,该地区的滩涂以每年50-200米的速度扩张。因此,沿海盐渍土(滩涂地区)被认为是农业发展的储备地,具有很大的潜力,可以缓解我国土地资源不足的压力。
    然而,沿海滩涂地区由于其高盐度,通过高渗透胁迫、营养缺乏、毒性和不良的物理土壤条件抑制了大部分作物,因此沿海滩涂地区通常具有植物生长不良和微生物活性低的特点。因此,除了培育耐盐植物品种外,还需要可持续的生物技术来提高沿海盐土的质量,特别是那些通过植物根系和微生物群之间的互作来发挥作用的技术。为了提高土壤肥力和作物产量,人们尝试了各种技术来改良沿海盐渍土,包括化学、物理、生物和工程改良。例如,Liu等人(2015)发现,在牛粪、石膏和一种新的改良剂产品的应用中,牛粪通过引入丰富的有机质(OM),从而提高土壤微生物活性,在改善滨海盐土性质方面取得了富有希望的成果。此外,Chen等人(2016)的研究表明,施用富含真菌木霉菌的生物有机肥可使盐地碱蓬的生长量增加83%,并显著改变土壤微生物生物量。显然,有机堆肥或生物功能性有机肥与不同比例的化肥的结合在这一领域受到越来越多的关注。在农业中,富含有益微生物的有机生物肥与化肥的结合使用,是提高土壤肥力,增加土壤有机质、孔隙、持水能力和微生物活性,同时减少化肥施用总量(可能导致沿海生态系统次生盐碱化)的一种很有前景的途径。
    土壤微生物群落在调节植物耐盐性和提高盐渍土壤质量中起着关键作用。然而,对于微生物群对盐渍土中外源添加的反应,尤其是在这种情况下细菌群落的装配动力学,人们知之甚少。在过去的十年中,高通量测序极大地扩大了我们对不同生态系统中细菌群落的理解,虽然这种方法对于确定样本中不同微生物类群的相对丰度很有价值,但是它并不能准确提供不同样本间目标微生物丰度差异的信息。最近,研究人员开始使用绝对定量16S rRNA测序方法来解决这一领域的技术挑战。本研究的目的是:1)用微生物绝对定量方法揭示不同施肥条件下盐渍土细菌群落的变化,揭示土壤微生物组成与土壤化学性质的关系。2)在番茄盆栽和田间试验的基础上,确定沿海盐渍土生态系统可持续农业发展的最佳施肥量。

研究方法:

田间试验场地及设计

    野外试验场位于江苏省大丰市的潮坪地区,面对黄海,该地区属北亚热带季风气候,四季分明,年平均降雨量1058毫米,年平均气温15°C,年平均日照2280小时,具有典型的滨海盐渍土。本研究所采用的肥料为商业化生物有机肥(鸡粪中添加107孢子/g 的植物益生菌木霉菌NJAU 4742),化肥包括尿素、过磷酸钙和硫酸钾。设计了以下田间施肥处理:1)100%生物有机肥(100BF),2)70%生物有机肥和30%化肥(70BF),3)30%生物有机肥和70%化肥(30BF),4)100%化肥(CF)。每种施肥方式都有五个重复地块,每个地块为8.0 m2(4.0 m×2.0 m),长有21株4周龄的番茄幼苗。在2018年期间,番茄植株生长100天,并记录了有关番茄产量数据,五个植株(带水果)被从地里转移到实验室。

盆栽试验设计:

    为了更有效地研究不同施肥对盐渍土微生物群的影响,从田间试验相同区域(0-20cm深)采集了200kg的土壤,并转移到玻璃房进行盆栽试验。盆栽试验进行了两次,施肥处理与田间试验相同。每种处理有5个盆栽,每个盆栽含有2.8kg的土壤和1个番茄幼苗。在自然光条件下,随机放置在20-30°C的玻璃室内。种植后第42天,按照上述田间试验方法采集植物样本,土壤样本在同一天从每个盆栽中采集。

样品制备和分析

    测定土壤化学性质,包括土壤盐渍度、土壤pH值、总磷、总钾、硝态氮、有效磷和有效钾。在田间试验和盆栽试验中,对每株植物的株高和茎粗进行人工记录,然后对植物样品(茎和根)进行干燥,以测量干重和进行营养分析(如测定番茄果实中的维生素C含量、NO3-含量、总蛋白质含量和可溶性糖含量)。

16S扩增子绝对定量测序:

    为了观察施肥前后土壤微生物群的变化,未施肥初始土壤样品也被纳入分析。因此从盆栽试验的四个处理(CF、30BF、70BF和100BF)中收集的20个土壤样品加上5个初始土壤样品被送往上海天昊生物科技有限公司进行细菌16S扩增子绝对定量测序(V4-V5区域)。

研究结果:

田间试验番茄产量与品质

    盐渍地番茄产量和果实品质受施肥影响较大(表1)。在四种施肥方式中,70BF处理的番茄产量显著最高。70BF处理使番茄产量分别比CF、30BF和100BF提高了17.2%、25.9%和23.6%。经生物有机肥(BF)处理的番茄(30BF、70BF、100BF)其蛋白质含量随生物有机肥施用量的增加呈增长趋势,而果实中硝酸盐的积累呈相反的趋势。四种处理间可溶性糖积累无显著性差异。生物有机肥(BF)处理的番茄根系生长量比化肥(CF)处理的番茄根系生长量增加,表现为根系干生物量。

表1田间试验中不同处理对番茄产量、品质及根系生长的影响

    此外,表2中所示的番茄植株生长和营养特性表明,生物有机肥施用(30BF、70BF、100BF)比化肥(CF)处理的植株生长更好,磷吸收更高。在三种BF处理中,70BF和100BF处理的株高显著高于30BF。

表2田间试验中不同处理对番茄植株生长和营养的影响

盆栽试验中番茄生长及土壤性状的研究

    盆栽试验中番茄幼苗的生长(表3)证实了田间四种施肥方式对番茄生长影响的结果。此外,盆栽试验中30BF和CF处理的根系生长(以根系干重表示)比田间试验增加更显著,而四种处理之间的茎径无显著差异。

表3盆栽试验中不同处理对番茄植株生长和营养的影响

    同时,与初始未施肥土壤(CK)相比,四种施肥方式对土壤化学性质的影响有显著性差异(图1)。具体来说,土壤中的酸碱度、硝酸盐氮和有效钾(AK)呈明显的下降趋势,按CF>30BF>70BF>100BF的顺序排列。经生物有机肥(BF)改良后的土壤中的OM和有效磷(AP)明显高于CF处理后的土壤和CK土壤。施肥土壤中的阳离子量(以ECe值表示),相对于对照样品中的阳离子量,无论肥料输入的形式如何,累积了3.3-3.8倍。

图1盆栽试验中不同施肥处理对土壤化学性质的影响

土壤细菌群落的绝对定量

    清除模糊、低质量序列和singleton OTU后,25个土壤样本共得到5,282,236条reads(含Spike-in序列),每个样本生成的OTU数量从3124到4252不等,并由RDP数据库进一步分类。生成的OTU的维恩图显示了核心微生物群,所有样本中共享3331个OTU。根据Spike-in生成的标准曲线进行微生物绝对定量。
    每克土壤的估计绝对拷贝数如图2a所示,相应的门水平相对丰度如图2b所示。与未施肥的初始样品(CK)相比,经过肥料处理的样品中细菌的总丰度增加了2.6-3.8倍,70BF样品中细菌的总丰度显著最高,其次是CF样品。所有测试样品中以Proteobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi, Actinobacteria, Firmicutes, Planctomycetes, Acidobacteria为优势菌门。

图2 所有土壤样品中主要细菌门的绝对丰度(A,每克土壤中16S rRNA基因拷贝数)和相对丰度(B,%)。

    四种处理的土壤中细菌种类对施肥量的响应不同,形成了具有不同α多样性指数的群落(表S1),尽管施肥处理后的土壤细菌总数显著增加,但这些样品(CF、30BF、70BF和100BF)中的细菌多样性较未处理土壤样品(CK)明显降低,其中,CF处理导致细菌多样性的损失最大(显示最低香农值的多样性)。
    根据PCoA(按Bray Curtis计算,如图3a所示)和平均连锁层次聚类(UPGMA,按Bray Curtis计算,如图3b所示),用PCo1(53.64%)将初始土壤(CK)的细菌群落与四种施肥土壤的细菌群落明显分离;用PCo2(29.66%)将CF处理土壤的细菌群落与BF处理土壤的细菌群落明显分离,相比之下,两个较高的BF处理(70BF和100BF)不能清楚地彼此分离。

图3 细菌群落的主坐标分析(A,PCoA)和层次聚类树(B)(以Bray Curtis计算)

    属水平上进行的热图分析(图4)也显示细菌群落组成的集群模式与PCoA观察到的集群模式相似。在施肥处理(CF和BF系列)中,大多数被选的菌属(前100个)的绝对丰度明显高于CK土壤,如图所示,红色/橙色柱状物更多。此外,BF系列土壤的细菌组成比CF土壤中的细菌组成更均匀,如颜色强度所示。

图4 土壤样品中100个最丰富细菌属的热图分析

细菌群落与土壤化学属性的关系

    为了确定影响本研究盐渍土壤细菌群落组成的因素,进行了RDA(图5)和Pearson相关分析。土壤样本根据门水平细菌群落组成分为三组(图5)。第一组分(RDA1)从肥料处理样品(CF和BF系列)中分离出初始土壤样品(CK),解释了70.59%的变化。第二组分(RDA 2)仅解释了18.98%的变异,并从BF系列样品中分离出了CF样品。土壤酸碱度与大多数优势种呈负相关,其它5个土壤参数(包括土壤OM、EC、硝酸盐N、有效磷和有效钾)与细菌丰度呈正相关(图5)。例如,肥料处理土壤中的Bacteroidetes和 Proteobacteria含量较高,与土壤EC含量较高呈正相关。有趣的是,在六个试验土壤参数中,土壤中的HE-OM比其他五个参数的重要性要小。而土壤养分有效性参数如有效磷、有效钾、硝酸盐N、土壤ECe对盐渍土微生物群落的驱动作用较强。

图5 RDA确定了构成细菌群落的六个选定环境变量。

    此外,还计算了番茄根系生长与属水平细菌绝对丰度的皮尔逊相关系数。根生物量与前30个属中的15个(包括一些重要的属,如Pseudomonas假单胞菌和Sphingopyxis)呈正相关,还包括5个属(Gp6、Sphingomonas鞘膜单胞菌、Chitinophaga、Rhizobium根瘤菌和Flavisolibacter),这些属只有在加载有机物后才会富集。

结果展示

1) 样本OTU代表序列对应物种16S rRNA基因绝对拷贝数计算

    a) 向样本中添加外标序列,然后对样品DNA和外标序列 DNA进行16S扩增子测序。

    b) 使用外标序列 DNA的序列数,结合其绝对拷贝数,以log(copies)为横坐标,log(reads)为横坐标,绘制标准曲线:

图1 Y4样品的标准曲线

    c) 根据标准曲线计算的样品中优势OTU序列(Top10)的起始拷贝数:

表1 根据标准曲线计算的样品中优势OTU序列(Top10)的起始拷贝数

    d) 根据各样品内部的标准曲线计算出各样本总细菌绝对拷贝数和各菌种绝对拷贝数情况:

图2 每个样品的总细菌绝对拷贝数和各优势菌种绝对拷贝数情况(Top 20个OTUs)

2) 外标序列的添加对样本原有群落组成影响不大

    以下是比较淤泥样本A两次测序结果,两次测序编号分别为A_V4(未添加内标序列)、Y42_V4(添加106 copiesn内标序列)。

    a. 同一样本添加不同拷贝数外标序列测序物种相对丰度比较(genus水平):

图3 属(genus)水平群落组成柱状图

    结果显示:Y4_V4、Y42_V4样本优势菌属完全一致,且这些菌属在各个样本中的相对丰度比较一致,说明内标序列的添加对样本属水平的群落组成无明显影响,添加内标序列后的样本16S测序结果也能反映样本本身群落组成情况。

    b. 同一样本添加不同拷贝数外标序列得到的优势OTU代表序列拷贝数:

图4同一样本中添加不同拷贝数内标序列得到的优势OTU代表序列拷贝数

    结果显示:比较同一样本中添加不同量外标序列测得的优势OTU代表序列的绝对拷贝数,结果发现Y42_V4(添加106 copies 外标序列)和Y4_V4(添加107 copies 外标序列)同一OTU代表序列拷贝数一致性较好,说明添加外标序列对样本中细菌进行绝对定量的方法重复性和稳定性均较好,能够真实定量出样本中各个物种的绝对丰度。

3)该方法和qPCR绝对定量相比,准确度在同一水平

    比较了微生物16S扩增子绝对定量测序方法与qPCR绝对定量方法所测定的同一系列样本的细菌总拷贝数,Pearson相关性分析结果显示:相关系数大于0.9,且两种方法计算的细菌总拷贝数值较为接近,未超过一个数量级,说明通过微生物16S扩增子绝对定量测序技术进行微生物绝对定量是可靠准确的。

图5 16S扩增子绝对定量测序和荧光定量qPCR两种方法检测一系列样本细菌总拷贝数的相关性分析

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