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微生物16S扩增子绝对定量测序

微生物16S扩增子绝对定量测序

技术简介:

      16S rRNA基因扩增子高通量测序,是通过对基因组目的区域进行PCR扩增,将目标区域DNA扩增富集后进行高通量测序的研究策略,可有效研究特定环境中的物种信息,检测几十至几百种微生物特性。近来,特定环境样本中某一类群微生物的绝对定量问题受到越来越多研究学者的关注,以往都是通过特定物种的qPCR绝对定量进行检测,但qPCR定量实验结果常常不稳定,且特定物种qPCR需要设计特定引物,对引物特异性要求较高,且引物优化难度较大,导致常规的qPCR绝对定量实验不再适用于组成较为复杂的环境样本微生物绝对定量。目前,16S rRNA基因测序手段通过某一OTU分类单元的序列数占总序列数的比值来获得相对丰度数据,然而相对丰度信息不能反映环境样本中物种绝对丰度情况。
      而基于16S 外标序列的微生物绝对定量测序恰好能够获得样本中物种的绝对丰度数据。该方法通过向样品DNA中添加一定量外标序列,进行16S扩增子文库构建、测序,再根据外标序列的16S扩增子reads数及其绝对拷贝数绘制标准曲线,计算出样品中OTU代表序列对应物种16S rRNA基因绝对拷贝数。该方法是一种将qPCR绝对定量技术和常规16S扩增子测序技术合二为一的技术,该技术不但可以进行Alpha多样性分析、群落组成分析、Beta多样性分析和环境因子分析等常规扩增子测序分析,而且可以解析样本中总细菌和特定菌种的绝对拷贝数,该技术充分发挥了“常规16S扩增子测序(细菌群落结构)+qPCR(细菌绝对拷贝数)” 两种检测技术的各自优势,变‘两张皮’为‘一盘棋’, 最大限度地便利了广大微生态研究者。

技术优势:


     • 数据量大:不低于15万reads/样品,可检测环境微生物群落中的痕量菌,以及发现新的微生物。
     • 方案经济便捷:单个16S扩增子测序可同时获得样本中微生物的组成信息和绝对定量数据。
     • 适用范围广:可同时得到样本中绝大多数优势物种的绝对定量数据,该方法具有普遍适用性。
     • 真实、准确:绝对定量数据,测序结果真实,客观还原菌群结构及丰度比例,无样品偏差可直接比较。

应用领域:

     • 微生物菌种绝对定量
     • 微生物菌群进化分析
     • 微生物菌群丰度分析
     • 环境与生态研究
     • 疾病和个体化医疗

技术参数与实验流程


技术参数


测序类型 推荐区域 样本要求 测序策略 数据要求
微生物16S扩增子绝对定量测序
  • V3
  • V4
  • V3+V4
  • V4+V5
  • 样品类型:常规土壤样本和人粪便DNA,无明显降解;
  • 样品需求量:总量>500ng;浓度≥20ng/μL;
  • 纯度:OD260/280=1.7-2.0。
  • Illumina 2×250
  • Illumina 2×150
每个样本有效序列≥15万条,Raw data Q30数据达到70%以上,Clean data Q30数据达到80%以上。

分析内容


标准分析
数据统计与优化 OTU分类分析
原始序列数据统计 优化序列数据统计 OTU聚类分析 分类学分析
/ / 物种注释统计 进化树分析
/ OTU绝对定量
/ / 样本OTU Id对应的物种绝对拷贝数统计 /
群落组成分析 Alpha多样性分析
单样本物种组成饼图 单样本多级物种组成图 多样性指数分析 多样性指数差异分析
分类学系统组成树 物种总丰度柱状图 稀释性曲线 Shannon-Wiener曲线
丰度分布Bubble图 多样本群落结构柱状图 Rank-Abundance曲线 物种累积曲线
样本聚类树柱状图 Heatmap热图 / /
Metastats分析 / / /
Beta多样性分析 /
Venn图分析 样本聚类树图 / /
PCA分析 PCoA分析 / /
NMDS分析 ADONIS分析 / /
Lefse分析 / / /
高级分析项目
环境因子分析 可选分析
Mantel test分析 Bioenv分析 PD分析 3D-PCoA分析
物种与环境因子相关性分析 RDA/CCA分析 PLS-DA分析 ANOSIM分析
/ / Metagenomeseq分析 Wilcoxon秩和检验/ANOVA分析
/ / PICRUSt功能分析 优势物种网络图分析
/ / Indicator分析 OTU富集三元相图

服务流程


结果展示

1) 样本OTU代表序列对应物种16S rRNA基因绝对拷贝数计算

      a) 向样本中添加外标序列,然后对样品DNA和外标序列 DNA进行16S扩增子测序。

      b) 使用外标序列 DNA的序列数,结合其绝对拷贝数,以log(copies)为横坐标,log(reads)为横坐标,绘制标准曲线:

图1 Y4样品的标准曲线

      c) 根据标准曲线计算的样品中优势OTU序列(Top10)的起始拷贝数:

表 1根据标准曲线计算的样品中优势OTU序列(Top10)的起始拷贝数
#OTU ID Y4_V4 OTUreads Y4_V4 copies Y4_V4 log(OTUreads) Y4_V4 log(copies)
OTU60477547.72E+064.679016.887707
OTU860529.55E+053.7818995.980068
OTU7338206.00E+053.5820635.777887
OTU6336505.73E+053.5622935.757884
OTU7230284.74E+053.4811565.675795
OTU7130174.72E+053.4795755.674196
OTU7920643.22E+053.314715.507395
OTU5216522.57E+053.218015.409561
OTU7614372.23E+053.1574575.348297
OTU848921.38E+052.9503655.138775

      d) 根据各样品内部的标准曲线计算出各样本总细菌绝对拷贝数和各菌种绝对拷贝数情况:

图2 每个样品的总细菌绝对拷贝数和各优势菌种绝对拷贝数情况(Top 20个OTUs)

2) 外标序列的添加对样本原有群落组成影响不大

      以下是比较淤泥样本A三次测序结果,三次测序编号分别为A_V4(未添加外标序列)、Y42_V4(添加106 copies外标序列)、Y4_V4(添加107 copies外标序列)。

      a. 同一样本添加不同拷贝数外标序列测序物种相对丰度比较(genus水平):

表 2 三次测序属水平相对丰度统计表(优势物种相丰度大于0.1%)
genus A-V4序列数 A-V4相对丰度 Y42_V4序列数 Y42_V4相对丰度 Y4_V4序列数 Y4_V4相对丰度
Ethanoligenens6457346.04%60384 49.97%4785059.06%
Bifidobacterium1679111.97%15959 13.21%63257.81%
Clostridium_sensu_stricto1482610.57%13244 10.96%74789.23%
Clostridium_IV138459.87%11599 9.60%840310.37%
Unassigned131219.35%10382 8.59%59577.35%
Prevotella61264.37%3341 2.76%17322.14%
others60624.32%1629 1.35%9101.12%
Dialister14321.02%925 0.77%5590.69%
Lactococcus9010.64%531 0.44%2750.34%
Lactobacillus3900.28%447 0.37%1710.21%
Aeromonas3660.26%213 0.18%1260.16%
Methanobacterium3520.25%232 0.19%1140.14%
Dysgonomonas3040.22%222 0.18%1020.13%
Clostridium_XlVb2920.21%219 0.18%1090.13%
Oscillibacter1760.13%149 0.12%840.10%
Atopobium1600.11%125 0.10%600.07%
others5520.39%1242 1.03%7620.94%

图3 属(genus)水平群落组成柱状图

      结果显示:Y4_V4、Y42_V4、A_V4样本优势菌属完全一致,且这些菌属在各个样本中的相对丰度比较一致,说明外标序列的添加对样本属水平的群落组成无明显影响,添加外标序列后的样本16S测序结果也能反映样本本身群落组成情况。

      b. 同一样本添加不同拷贝数外标序列得到的优势OTU代表序列拷贝数:

表3 同一样本中添加不同拷贝数外标序列得到的优势OTU代表序列拷贝数
#OTU ID Y4_V4 OTUreads Y4_V4 copies Y4_V42 OTUreads Y4_V42 copies
OTU60477547.72E+06602307.34E+06
OTU860529.55E+05154311.69E+06
OTU7338206.00E+0569607.13E+05
OTU6336505.73E+0550615.05E+05
OTU7230284.74E+0547244.69E+05
OTU7130174.72E+0539533.87E+05
OTU7920643.22E+0534643.35E+05
OTU5216522.57E+0532003.08E+05
OTU7614372.23E+0525172.38E+05
OTU848921.38E+0516751.53E+05

图4同一样本中添加不同拷贝数外标序列得到的优势OTU代表序列拷贝数

      结果显示:比较同一样本中添加不同量外标序列测得的优势OTU代表序列的绝对拷贝数,结果发现Y42_V4(添加106 copies 外标序列)和Y4_V4(添加107 copies 外标序列)同一OTU代表序列拷贝数一致性较好,说明添加外标序列对样本中细菌进行绝对定量的方法重复性和稳定性均较好,能够真实定量出样本中各个物种的绝对丰度。

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